宋靜武 彭 磊

(1.秭歸縣林業(yè)局 林業(yè)科學(xué)技術(shù)推廣中心 宜昌 443600; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院 昆明 650201)

1 實驗?zāi)康?/h2>

核桃(JuglansregiaL.)又被稱為胡桃、羌桃，是一種胡桃科植物。核桃極具營養(yǎng)價值，核桃中脂肪和蛋白質(zhì)含量較高，又含有人體所需很多種礦物質(zhì)和微量元素，又富含多種維生素。核桃是一種極為重要的經(jīng)濟(jì)樹種，能為我國核桃產(chǎn)區(qū)帶來極大地經(jīng)濟(jì)效益。核桃樹抗寒能力較弱，在受到低溫凍害、寒害以及晚霜等非生物脅迫時會造成花芽枯死和枝條抽干，這會影響樹體的正常生長結(jié)實，會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并限制了良種核桃的地理分布。為了提高核桃的經(jīng)濟(jì)和產(chǎn)業(yè)價值，研究人員利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)方法，希望能夠改良核桃品質(zhì)、探索核桃抗寒機(jī)制的分子機(jī)理、運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高抗性核桃新品種等工作進(jìn)行研究。

CBF/DREB1(C-repeat binding factors /dehydration response element binding factors1)蛋白是植物體內(nèi)低溫信號傳導(dǎo)途徑中研究最為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子基因[1]。這個家族在抗寒，抗堿，抗鹽方面有很大作用[2]。擬南芥作為一種常用模式植物，Yamaguchii[3]在極端的干旱和低溫脅迫的條件下對擬南芥進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)擬南芥的RD29A基因的啟動子區(qū)域中分離出了了DRE順式作用元件(1994)，這些元件含有相同的CCGAC序列。隨著研究發(fā)現(xiàn)CRT/DRE和其核心序列，常出現(xiàn)在冷誘導(dǎo)以及干旱誘導(dǎo)基因的啟動子中，這是冷誘導(dǎo)過程中必要的一類基因[4]。2002 年，Haake等又分離出了這個家族的第 4 個成員CBF4，CBF4的轉(zhuǎn)基因植物能觀測與表達(dá)和CBF1一樣具有抗寒性顯著提高結(jié)果[5]。氨基酸序列分析表明，CBF中含有AP2結(jié)構(gòu)區(qū)，AP2結(jié)構(gòu)域第一個DNA結(jié)合區(qū)，它的作用是結(jié)合CRT/DRE順式作用元件，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)，通過合成膜穩(wěn)定蛋白、脯氨酸、糖類等物質(zhì)，改變細(xì)胞生理環(huán)境進(jìn)而提高植物的抗寒性[6]。CBF基因的冷誘導(dǎo)不會受自身調(diào)節(jié)影響，所以這個轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)該是其他蛋白，他們假設(shè)這種轉(zhuǎn)錄因子為ICE(inducer of CBF expression)。正常條件下ICE不處于活動狀態(tài)，植物體可能通過某種條件將ICE隔離在體內(nèi)，當(dāng)植物受到冷刺激時ICE會被釋放出來，從而激活一條信號途徑，使CBF基因能夠進(jìn)行表達(dá)[7]。Chinnusamy等在2003年首次分理出ICE1基因[8]，經(jīng)過數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)ICE1的C端含有一個近似MYCbHLH(MYC-likebasic helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)與bHLH蛋白相似，bHLH蛋白能夠識別DNA中的某些元件，而CBF3中含有多個這樣的元件[9]，這也說明了ICE能特異的與CBF3中的特定識別序列結(jié)合。LOS4-1是CBF基因的一個正向調(diào)控因子，是由Guo研究擬南芥突變體時發(fā)現(xiàn)的(2002)，這種基因突變的擬南芥對低溫的抵抗能力比野生型在24H內(nèi)降低了40%[10]。LOS基因編碼一種能夠抑制STZ/ZAT10的活性的生物活性酶(STZ/ZAT10能夠抑制冷誘導(dǎo)基因RD29的表達(dá))[11]，但是LOS的一個突變LOS4-2卻會增強(qiáng)CBF及其靶基因的表達(dá)[12]。Lee[13]等發(fā)現(xiàn)了一個與滲透壓相關(guān)的CBF負(fù)調(diào)節(jié)因子稱為HOS1(high expression of osmoticstress regulated gene expression 1)，HOS編碼環(huán)脂蛋白，當(dāng)受到低溫刺激時會在細(xì)胞核內(nèi)大量積聚，抑制CBF基因表達(dá)。Liu等的研究表明，正常狀況下PtrHOS1基因在枳(Poncirus trifoliata (L.) Raf.)莖葉、根部都有很強(qiáng)的表達(dá)，經(jīng)過低溫處理后出現(xiàn)了短暫的下調(diào)，說明HOST1基因表達(dá)受到低溫影響[14]。SFR6蛋白(sensitive to freezing 6)是一種對低溫敏感的蛋白也是一個特例，這種蛋白是CBF下游正調(diào)節(jié)因子，能夠下調(diào)那些啟動子結(jié)構(gòu)不含有CRT/DRE元件的基因[15～17]。在植物受到低溫刺激時，CBF基因轉(zhuǎn)錄水平會迅速提高，隨后含有CRT/DRE調(diào)節(jié)元件的COR基因啟動子會與CBF基因結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)COR表達(dá)。COR基因在低溫條件系會對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，會降低細(xì)胞內(nèi)的一部分多余物質(zhì)的含量，從而提高植物抗寒性[18～19]。COR是一種冷應(yīng)答蛋白，當(dāng)植物受到干旱鹽堿寒冷的脅迫時會被誘導(dǎo)產(chǎn)生[20]。目前對于COR類基因的研究較多，如擬南芥的COR78基因啟動子常用于非生物脅迫誘導(dǎo)啟動子來增強(qiáng)植物抗逆性，這種啟動子比組成型啟動子更能減小植物生長中的一些負(fù)面作用[21]。COR15a基因表達(dá)產(chǎn)生的物質(zhì)會與葉綠體結(jié)合，形成一種能夠保護(hù)原生質(zhì)體和葉綠體的物質(zhì)，進(jìn)而提高植物細(xì)胞的抗寒性[22]。 有關(guān)研究表明，CBF基因為AP2/EREBP 超家族的DREB家族成員，是從擬南芥、甘薯等植物中發(fā)現(xiàn)的基因，在植物抗寒性研究中都起到關(guān)鍵性的作用。

CBF/DREB1蛋白是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的控制植物體內(nèi)低溫信號傳導(dǎo)的一類轉(zhuǎn)錄因子基因，也是現(xiàn)在研究最為廣泛的基因之一。近年來，隨著基因工程學(xué)科的不斷發(fā)展，從核桃中成功克隆出了許多影響核桃抗寒性的功能基因，相關(guān)研究只在研究單一低溫核桃相關(guān)基因的表達(dá)，但CBF基因在不同溫度處理表達(dá)的研究未見報道，因此，該課題對前人的研究進(jìn)行了深入和完善，這對研究核桃抗寒機(jī)制是十分必要的。為了了解核桃內(nèi)CBF基因?qū)Σ煌錅囟鹊捻憫?yīng)的變化，采用不同低溫梯度進(jìn)行處理，利用RT-PCR技術(shù)研究了在不同時間不同溫度下下‘陽光’‘云新’核桃葉片內(nèi)CBF基因在寒冷脅迫下表達(dá)量的變化規(guī)律，為以后選育核桃優(yōu)良抗寒品種等提供更多的參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗材料

試驗于2015年12月～2017年3月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院果樹生理實驗室進(jìn)行。試驗材料為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物育種實驗室盆栽‘陽光’、‘云新’核桃幼苗葉梢對生葉片，樹齡0.5 a，處于幼年期，樹高1 m，沒有嚴(yán)重病害，在正常生長條件下‘陽光’長勢優(yōu)于‘云新’核桃，但‘陽光’核桃更易受自然低溫和病害影響?！菩隆癁樵颇媳づc新疆核桃早實豐產(chǎn)雜交品種，‘陽光’為云南省選育的新品種。其中無病害室溫盆栽核桃作為空白對照，將整株核桃幼苗放入恒溫冰箱內(nèi)進(jìn)行活體2、4、6、8℃低溫脅迫處理，處理時間為2、4、8、24 h。處理完成后采摘新鮮葉片用錫紙包裹放入液氮浸泡，后放入超低溫冰箱保存。另一部分生理實驗材料，對處理后的新鮮核桃葉片立刻進(jìn)行殺青、曬干、研磨成粉狀放入塑封袋密封保存。

2.1.2 試驗試劑

植物RNA提取試劑盒；cDNA第一鏈合成試劑盒、10×Loading Buffer、Marker為DL2000；2×Power Taq PCR MasterMix；氯仿、瓊脂糖等為國產(chǎn)分析純試劑。

2.1.3 儀器

移液器、大號研缽、冷凍離心機(jī)、水平電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，eppendorf熒光定量系統(tǒng)；將清潔后的研缽等用錫紙包裹后，置于200℃以上烤箱烘烤處理；96孔0.2 mL PCR管盒、巴洛克無RNA酶槍頭、八連管、1.5 mL離心管、1.5 mL離心管盒、0.2 mL PCR管、96孔冷凍鋁板。

2.1.4 PCR 引物設(shè)計與合成

進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，在GenBank數(shù)據(jù)庫中輸入物種拉丁名Juglans regia L.及相關(guān)基因名稱CBF獲得取該基因的DNA或mRNA序列后，以其為模板使用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計。引物設(shè)計完成后，委托昆明碩擎生物科技有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物信息

2.2 方法

2.2.1 核桃葉片總 RNA 的提取

液氮覆蓋核桃新鮮葉片將其研磨成細(xì)粉末，待液氮揮發(fā)完后，用離心管估算裝取0.1 g樣品(可使用離心管稱取)，加入1 mL細(xì)胞裂解液，在振蕩器上振蕩30秒后使其混勻后取1 mL勻漿物轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL離心管中；在離心管加入300 μL去蛋白液和200 μL氯仿，在振蕩器上振蕩30 秒左右混勻；在常溫12 000 轉(zhuǎn)/分離心8分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移入干凈的1.5 mL離心管中，加入等體積的漂洗液，充分顛倒混勻，將混合物分2次在12 000 r/min常溫條件下離心1分鐘，棄去穿透液；加入500 μL洗柱液，12 000 r/min常溫離心1 分鐘，棄穿透液，重復(fù)一次該操作，然后常溫12 000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL離心管中，加入50 μL RNA洗脫液，放置片刻，12 000 r/min常溫離心1分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。分裝成5份，每份10 μL存放于超低溫冰箱待用。

2.2.2 RNA樣品電泳分析

取5 μL RNA樣品與等量的Buffer混勻，在1.5%瓊脂糖凝膠，1×TAE為電泳緩沖液，電壓為80 V的條件下電泳25 min，在凝膠成像儀上觀察RNA條帶呈像情況、并采集照片數(shù)據(jù)。

2.2.3 合成 cDNA 第一鏈

第一條鏈cDNA的合成按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa公司)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.4 基因特異引物的PCR

驗證以cDNA為模板，用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)設(shè)定合適的循環(huán)參數(shù)，反應(yīng)結(jié)束后4℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。

2.2.5 實時熒光定量PCR

樣本的制備后，上機(jī)進(jìn)行樣品檢測。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，利用軟件DPS 7.05對組間進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s 新復(fù)極差測驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 核桃抗寒相關(guān)基因在‘陽光’‘ 云新’核桃葉片受到不同溫度和時間脅迫后的表達(dá)分析

3.1.1 總RNA質(zhì)量及cDNA質(zhì)量檢測

由圖1和圖3可見，RNA 28S和18S條帶亮度的比例約為2∶1，泳道無明顯背景表明RNA樣品的完整性較好、純度較高，無明顯降解，可用來接下來的的反轉(zhuǎn)錄。

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖1 ‘陽光’核桃總RNA提取凝膠電泳圖像

1：6℃2H；2：6℃4H；3：6℃8H；4：6℃24H；5：8℃2H；6：8℃4H；7：8℃8H圖3 ‘陽光’核桃總RNA提取凝膠電泳圖像

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖4 ‘陽光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

1：4℃24H；2：6℃2H；3：6℃4H；4：6℃8H；5：6℃24H；6：8℃2H；7：8℃4H圖5 ‘陽光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

1：8℃8H；2：8℃24H；3：常溫1號；4：常溫2號；5：常溫3號圖6 ‘陽光’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

1：2℃2H；2：2℃4H；3：2℃8H；4：2℃24H；5：4℃2H；6：4℃4H；7：4℃8H圖7 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

1：4℃24H；2：6℃2H；3：6℃4H；4：6℃8H；5：6℃24H；6：8℃2H；7：8℃4H圖8 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

1：8℃8H；2：8℃24H；3：常溫1號；4：常溫2號；5：常溫3號圖9 ‘云新’核桃樣品cDNA質(zhì)量檢測凝膠呈像

如圖7和圖9所示，以加入上述提取的‘云新’核桃葉片cDNA為模板，可擴(kuò)增獲得1條清晰的片段，說明此方法提取的總RNA能夠滿足實時熒光定量PCR等以RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實驗。

3.1.2 CBF基因在‘陽光’‘云新’核桃葉片受不同溫度脅迫后隨時間變化在葉片內(nèi)的表達(dá)量分析

通過對‘陽光’核桃葉片組織進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)CBF在核桃葉片中有表達(dá)，在三個不同時間CBF在核桃葉片內(nèi)表達(dá)量均無明顯變化(圖10)。以核桃 18S 基因為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR方法分析‘陽光’核桃葉片CBF在2、4、6、8℃四個低溫脅迫下隨時間延長核桃葉內(nèi)基因表達(dá)量變化情況。其中在2℃條件下‘陽光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長有較小幅度的升高，并在2 h處理時達(dá)到最高值，在4 h時有小幅下降，在8 h時又有小幅升高，處理24 h后基本不再變化(圖11)。4℃條件下‘陽光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長有小幅變化，且變化并不明顯(圖12)。6 ℃條件下‘陽光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長在2 h升高達(dá)到最高值后在4 h降低,處理8 h后又有小幅升高，24 h后又出現(xiàn)小幅降低(圖3-13)，其中2 h處理與0、4、24 h處理相比差異性顯著。8 ℃條件下‘陽光’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長先升高，后隨著時間延長逐步降低，并在2H處理時達(dá)到最高值(圖14)與8 h、24 h處理相比差異性顯著。

圖10 CBF基因在常溫下不同時間在兩個品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖11 CBF基因在2℃處理不同時間在兩個品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖12 CBF基因在4℃處理不同時間在兩個品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖13 CBF基因在6℃處理不同時間在兩個品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

圖14 CBF基因在8℃處理不同時間在兩個品種核桃葉片內(nèi)表達(dá)量差異

通過對‘云新’核桃葉片組織進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)CBF在核桃葉片中有表達(dá)，在三個不同時間CBF在核桃葉片內(nèi)表達(dá)量均無明顯變化(圖3-11)。以核桃 18S基因為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR方法分析‘云新’核桃葉片CBF在2、4、6、8 ℃四個低溫脅迫下隨時間延長核桃葉內(nèi)基因表達(dá)量變化情況。但在2、4、6、8 ℃四個低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長均只有小幅變化，且變化不明顯(圖12～圖14)。在2℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長先降低后升高，然后趨于穩(wěn)定。在4 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長先降低后升高之后再次降低，并在8 h達(dá)到最高值。在6 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量出現(xiàn)很小幅變化，在2 h達(dá)到最高值。在8 ℃低溫條件下‘云新’核桃葉片內(nèi)的CBF基因表達(dá)量在隨著處理時間延長先升高后降低，并在2 h時達(dá)到最高值。

由以上實驗數(shù)據(jù)顯示，CBF在‘陽光’核桃低溫脅迫中起作用，在‘云新’核桃低溫脅迫中有表達(dá)，但表達(dá)量變化并沒有陽光核桃明顯。

CBF抗寒途徑是在高等植物中廣泛存在的抗寒抗旱、抗鹽堿信號傳導(dǎo)通路，植物通過CBF轉(zhuǎn)錄因子，激活下游COR、LTI、KIN基因的表達(dá)來提高植物抗寒性。李勇鵬從香樟中低溫誘導(dǎo)分離出了4種類CBF基因找到了控制香樟抵御逆境脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd[23]。吳純倩將擬南芥CBF3和CR15a冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入煙草，提高了煙草的抗寒性及在低溫時的光合作用率[24]。雷恒久等通過平歐雜交榛克隆出ChaCBF1基因，通過研究發(fā)現(xiàn)該基因會使植株積累較高水平的可溶性糖和游離脯氨酸來提高自身抗寒能力[25]。馮勛偉等將從結(jié)縷草中克隆出了CBF同源基因ZjCBF轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)即使不進(jìn)行冷馴化ZjCBF過量表達(dá)的植株也比野生型抗寒性強(qiáng)[26]。張建朋等從麻核桃中克隆出jhCBF，序列分析說明JhCBF與樺木科白樺的親緣關(guān)系最近，優(yōu)先聚為一類[27]。近些年來，研究者們從茶樹、巨桉(Eucalyptusgrandis)、葡萄、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、扁桃(AmygdaluscommunisLinn.)等中都克隆出了類CBF基因，這些成果對研究抗低溫品種改良優(yōu)化起著重要作用[28-32]。雷恒久[25]等對平歐雜交榛葉片進(jìn)行4℃低溫處理發(fā)現(xiàn)ChaCBF1表達(dá)量隨時間延長均有升高。徐麗[33]等對‘香玲’核桃葉片在4℃脅迫后發(fā)現(xiàn)JrCBF基因隨處理時間延長出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢。這些研究均說明CBF基因在植物抗寒過程中起到了重要作用。

‘陽光’核桃中CBF基因在6℃和8℃低溫脅迫下表達(dá)量有所升高，這暗示CBF基因在低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用。但‘陽光’核桃中CBF基因在4℃脅迫下并無明顯的表達(dá)量變化，而是在6℃和8℃時出現(xiàn)明顯變化，但受冷脅迫刺激后基因表達(dá)量變化趨勢相同。徐麗等所處的地區(qū)為山東省地理氣候環(huán)境與云南省地理氣候環(huán)境差異較大，是否能夠說明不同地域的不同品種的核桃的抗寒能力存在不同，所以導(dǎo)致CBF基因受低溫刺激表達(dá)變化的溫度區(qū)間不同。本實驗就云南省廣泛種植的‘云新’‘陽光’兩種核桃中CBF基因進(jìn)行了低溫脅迫下表達(dá)量的研究。在實驗最后討論時發(fā)現(xiàn)‘云新’核桃在2℃～8℃CBF基因變化量不明顯，現(xiàn)階段并不能對討論所做的假設(shè)下定論。希望進(jìn)一步實驗?zāi)軌驅(qū)煞N核桃的綜合性抗寒指標(biāo)進(jìn)行測定，并選用不同樹齡植株材料，提供更大量的數(shù)據(jù)參考及使用更多品種核桃進(jìn)行冷脅迫基因表達(dá)量分析，來推斷這種特殊情況是否只在‘云新’這個品種出現(xiàn)。

4 結(jié)論

結(jié)論：‘陽光’‘云新’核桃CBF基因在葉片不同溫度處理下均有表達(dá)，但各個時間段表達(dá)量之間有一定的差異。其中‘云新’核桃在2 、4、6、8 ℃四個處理溫度中表達(dá)量較為平均，沒有明顯變化，而‘陽光’核桃在6 ℃處理組中2 h處理后和8 ℃處理組中2 h處理后CBF基因的表達(dá)量較高。各個核桃產(chǎn)地均處于獨(dú)特的地理氣候環(huán)境中，也都有適應(yīng)本土條件的核桃良種，核桃分子領(lǐng)域的研究基本為空白，希望通過這些研究為研究本土良種核桃抗寒生理及選育優(yōu)良抗性核桃品種提供一定參考與思路。