王毅敏 高 晗 高本旺 宋正江 陳發(fā)菊

(1.三峽植物園 宜昌 443111；2.三峽大學(xué) 宜昌 443000)

崖柏(Thujasutchuenensis)為柏科崖柏屬(Thuja)常綠喬木。有“植物大熊貓”、“活化石”之稱，是我國特有國寶級瀕危植物。因其生長在懸崖峭壁上，故而得名為“崖柏”[1]。它的分布范圍和居群數(shù)量己非常有限,僅發(fā)現(xiàn)于重慶市城口大巴山自然保護(hù)區(qū)和開縣雪寶山自然保護(hù)區(qū)、四川省萬源市花粵山自然保護(hù)區(qū)和湖北省保康縣五道峽自然保護(hù)區(qū)[2-3]，現(xiàn)在湖北省興山縣榛子鄉(xiāng)也只發(fā)現(xiàn)零星小居群。在實(shí)際觀測過程中發(fā)現(xiàn),崖柏居群分布地海拔較高,且常處于陡峭的山脊及山脊兩側(cè),自然條件惡劣(所受風(fēng)力較大,氣候寒冷),土壤層薄,營養(yǎng)狀況差?，F(xiàn)存的崖柏居群,處于島嶼狀的破碎生境中,各個(gè)居群植株數(shù)量少(而且有效居群大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際大小),大多呈小喬木或多分枝的大灌木狀態(tài)[4]。

崖柏由于自身固有的生物學(xué)特性和自然分布區(qū)惡劣的生態(tài)條件，具有發(fā)育緩慢、生殖遲緩、大種子、小收獲量和壽命長的特點(diǎn)。造成結(jié)實(shí)量低，種源奇缺，且種質(zhì)差，種子空粒多，種皮堅(jiān)硬，發(fā)芽率低，播種有隔年出苗的習(xí)性，靠種子繁殖困難。而利用扦插繁殖存在著年齡效應(yīng)、位置效應(yīng)及取材困難等諸多問題[5-6]。崖柏耐干旱適應(yīng)性強(qiáng)，適宜作為干旱立地條件栽培，目前的研究還處于種苗繁育階段，大大地限制了其推廣。所以，采用組織培養(yǎng)法對崖柏進(jìn)行離體快速繁殖探索具有重要的理論價(jià)值和明顯的現(xiàn)實(shí)意義。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是2016年4月采自湖北省宜昌市興山縣榛子鄉(xiāng)，選擇尚未木質(zhì)化的當(dāng)年生枝條，先用洗潔凈將表面灰塵雜物刷洗干凈，再用流動(dòng)清水沖洗1.5～2 h，將洗凈后的外植體剪成3～4 cm小段，置燒杯中，晾干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 0.1%升汞消毒處理外植體效果選擇試驗(yàn)

外植體先用75%酒精消毒 1 min，無菌水沖洗5次，然后用0.1%升汞消毒處理，無菌水沖洗5次，置無菌紙上，晾干后切成約1～2 cm長帶節(jié)莖段作為外植體，接種到事先準(zhǔn)備好的無菌培養(yǎng)基上，0.1%升汞消毒時(shí)間分別為4、6、8、10、12、14 min，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接90個(gè)。20 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)污染率、殺傷率，分析適宜的升汞消毒時(shí)間。

1.2.2 不同鹽濃度對外植體生長的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，調(diào)整大量元素的用量，設(shè)MS、1/2MS、1/4MS、0MS 4 個(gè)濃度梯度培養(yǎng)基，在無菌條件下，將消毒后的外植體切成約1～2 cm長的莖段分別接種到事先準(zhǔn)備好的不同鹽濃度的無菌培養(yǎng)基中，共設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接30個(gè)，置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，30 d后觀察不同鹽濃度對外植體生長的影響，確定適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基鹽濃度。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)計(jì)算方法

外植體消毒試驗(yàn)是組織培養(yǎng)獲得無菌系的關(guān)鍵，試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)用到的公式：

污染率(%)=(污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100(接種20天后統(tǒng)計(jì)污染外植體數(shù))

殺傷率(%)=(殺傷外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100(接種20天后統(tǒng)計(jì)殺傷外植體數(shù))

誘導(dǎo)率(%)=(成苗外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100(接種30天后統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)成苗數(shù))

采用SPSS軟件對不同消毒時(shí)間污染率、殺傷率差異進(jìn)行分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 0.1%升汞消毒處理外植體效果

統(tǒng)計(jì)不同消毒時(shí)間處理的三個(gè)重復(fù)的污染株數(shù)計(jì)算平均污染率和殺傷率見表1，消毒效果見圖1。

圖1 0.1%Hgcl 不同消毒時(shí)間對消毒效果的影響

表1 0.1%升汞不同消毒時(shí)間對消毒效果的影響

(注：培養(yǎng)室環(huán)境溫度 23～27 ℃，每日光照12～14 h，光照強(qiáng)度1500～2000 Lx ，相對濕度40%～80%。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖添加量30 g/L，瓊脂4.2 g/L，pH值5.8。)

表2 不同消毒時(shí)間污染率和殺傷率分析

用SPSS軟件對污染率和殺傷率進(jìn)行分析，說明不同消毒時(shí)間之間的污染率差異是極顯著的，處理6的污染率最低；處理1～5的殺傷率差異不顯著，處理6的殺傷率最高，故而，綜合考慮污染率和殺傷率的各時(shí)間段差異，處理5污染率較低，殺傷率也低，且時(shí)間短，所以選處理5。對試驗(yàn)結(jié)果圖表數(shù)據(jù)綜合分析之后得出：消毒時(shí)間在4 min至14 min之間崖柏外植體在0.1%升汞中的消毒效果差異顯著，殺傷率先為零，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到10 min以后殺傷整體趨勢是逐漸增大，當(dāng)0.1%升汞消毒時(shí)間達(dá)到12 min(處理 5)的時(shí)候污染率低，殺傷率也處于較低水平，表面滅菌效果最好,見表2。

2.2 不同鹽濃度對外植體生長的影響

表3 不同鹽濃度對外植體生長的影響

30天后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，隨著鹽濃度的降低，平均生長量先升高后降低，生長狀況由MS培養(yǎng)基上的強(qiáng)壯深綠到對照的弱小黃化；葉色隨著鹽濃度的降低而變淺，當(dāng)大量元素濃度為0時(shí)，新生葉黃化或白化。第2組處理 1/2MS 鹽濃度時(shí)生長狀況及生長量最好，新生芽深綠健壯，表明鹽濃度過高或過低對外植體生長都不利，比較理想的培養(yǎng)基鹽濃度應(yīng)該選擇1/2MS。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

崖柏外植體外植體先用75%酒精消毒 1 min，無菌水沖洗，0.1%升汞消毒處理隨時(shí)間的延長殺傷率增高、污染率降低，0.1%升汞消毒時(shí)間達(dá)到12 min(處理 5)的時(shí)候污染率最低，殺傷率也處于較低水平，表面滅菌效果最好。

培養(yǎng)基鹽濃度過高或過低對崖柏外植體生長都不利，1/2MS 鹽濃度時(shí)生長狀況及生長量最好，新生芽深綠健壯。外植體隨著鹽濃度的降低，平均生長量先升高后降低，葉色隨著鹽濃度的降低而變淺，當(dāng)大量元素濃度為0時(shí)，新生葉黃化或白化。

3.2 討論

崖柏組織培養(yǎng)研究未見報(bào)道，但近緣植物松科中的雪松、白皮松、金錢松、長白落葉松和興安落葉松，柏科中的黃柏、側(cè)柏、絨柏、金黃球柏、叉子圓柏的組織培養(yǎng)國內(nèi)外有一些報(bào)道，大多數(shù)研究者選擇生長季節(jié)采取外植體，消毒處理后進(jìn)行培養(yǎng)[7-9]。外植體的消毒方法很多，其中酒精與升汞交互消毒是目前使用廣泛、效果較好的消毒方法。對側(cè)柏、絨柏、叉子圓柏、崖柏等柏科植物，枝葉外備較厚角質(zhì)層，有油脂，消毒滅菌難是普遍問題。用延長消毒時(shí)間的辦法來解決這個(gè)問題，但消毒時(shí)間過長又容易殺傷組織，成活率降低。故而，本試驗(yàn)選取當(dāng)年生崖柏莖段做外植體，適宜的消毒時(shí)間為75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞消毒12 min，效果較好。

齊力旺等(1995)在側(cè)柏的組織培養(yǎng)和植株再生試驗(yàn)研究結(jié)果表明，SH培養(yǎng)基不適于側(cè)柏組織培養(yǎng)，并篩選出基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[9]。王建華等(2006)在絨柏的組織培養(yǎng)和植株再生,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[10]；李春艷等(2000)在臭柏愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)研究結(jié)果表明在離體培養(yǎng)條件下，取當(dāng)年生叉子圓柏莖尖、莖段、葉及根尖為外植體，在MS培養(yǎng)基上獲得愈傷組織[11]。本試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，得到比較理想的崖柏莖段分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)基為 1/2MS，為今后進(jìn)一步研究崖柏?zé)o菌系建立的方法，建立無菌系繼續(xù)擴(kuò)大基本培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和創(chuàng)造利于生根的各種環(huán)境等奠定了基礎(chǔ)。