朱 蕾，張愛靜，王鵬杰，夏 凡，董 月，高瑀瓏*

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

假單胞菌是一種能在低溫下生長、可利用多種有機(jī)物、分解能力強(qiáng)、可產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物的低溫食品腐敗菌。因此，假單胞菌污染乳制品、肉制品、禽蛋類和蔬菜等食品后極易引起腐敗變質(zhì)，是使這些食品腐敗變質(zhì)的重要微生物[1]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌中最常見的一個(gè)種，又稱綠膿桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤以及人體的呼吸道、皮膚和腸道等處，尤其在潮濕的自然環(huán)境中更易生長繁殖，所以其傳播途徑廣泛[2]。銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，可引起人類急性腸道炎、皮膚炎、敗血病和腦膜炎等疾病，其產(chǎn)生的內(nèi)、外毒素均具有致病性：內(nèi)毒素能引起系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征，對老人、小孩等抵抗力較弱的群體危害較大；外毒素侵入敏感細(xì)胞后，引起哺乳動物蛋白合成受阻，臨床上常引起繼發(fā)性感染[3-4]。2014年之前，在食品衛(wèi)生監(jiān)測工作中對銅綠假單胞菌監(jiān)控較少，與其食物中毒相關(guān)的報(bào)道也較少，但由于其對抗生素等化學(xué)治療劑有較強(qiáng)的抵抗性[5]且分布廣，在食品中污染機(jī)會較多，有報(bào)道建議將其列入食物中毒致病菌目錄[6]。2003年，黃美子等[7]報(bào)道了食用新鮮豬肉后出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀的案例，經(jīng)衛(wèi)生防疫部門鑒定是由銅綠假單胞菌引起的。2010年，沈瑛等[8]也報(bào)道了銅綠假單胞菌引起食物中毒的事件。2014年，我國對瓶裝飲用水等衛(wèi)生檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂，增加了對銅綠假單胞菌的監(jiān)測檢驗(yàn)，并將其確認(rèn)為食源性和水源性致病菌。

隨著人們對食品安全的重視，食品微生物安全預(yù)測逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。食品微生物預(yù)測學(xué)是一門基于微生物學(xué)、應(yīng)用計(jì)算機(jī)學(xué)、工程數(shù)學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)等的綜合學(xué)科。微生物預(yù)測模型的建立有利于對食品在貯藏、運(yùn)輸和銷售期間微生物變化的監(jiān)測，了解其存活信息[10]，為食品微生物安全控制提供科學(xué)的理論依據(jù)[11]。微生物生長預(yù)測模型主要有一級模型和二級模型。一級模型描述微生物數(shù)量對時(shí)間的響應(yīng)，常見的一級模型有Linear模型、Logistic模型[12]和Gompertz模型[13]等。Linear模型的操作簡便，但預(yù)測數(shù)據(jù)的精確度不高；Logistic模型在數(shù)學(xué)上是用于描述一個(gè)普通笛卡爾平面上的S形曲線，有人用其研究細(xì)菌生長曲線，但其不能完整顯示S形曲線，是一個(gè)無滯后期的S形曲線[12]；而Gompertz模型克服了這些缺點(diǎn)，在目前應(yīng)用較多[9]。Gompertz模型能夠較好地用于研究單細(xì)胞微生物生長的典型生長曲線，在研究細(xì)菌生長的延滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期時(shí)，分別用延滯時(shí)間（λ）、最大比生長速率（μmax）、最大菌落數(shù)（b）來描述這3 個(gè)階段的特征。在食品貯藏期間：λ可用于分析食品貨架期的參數(shù)，表示食品安全貯存時(shí)間的長短；μmax是微生物生長動力學(xué)參數(shù)，表示食品腐敗變質(zhì)的速率；b表示在腐敗變質(zhì)的食品中微生物的最大生長量。目前，國內(nèi)外對一些食品基質(zhì)中微生物生長模型的建立已有一些報(bào)道，但是對于銅綠假單胞菌在食品中預(yù)測模型的研究鮮有報(bào)道。鄒宇等[14]運(yùn)用Gompertz模型、Logistic模型建立了在低溫下牛乳中李斯特氏菌的生長模型，發(fā)現(xiàn)Gompertz模型為李斯特氏菌在牛乳中生長的最適模型；M?ller等[15]在新鮮牛肉中建立了沙門氏菌的生長模型；Lee等[13]用Gompertz模型和Logistic模型擬合了生豬肉中李斯特氏菌的生長曲線。目前，用來研究微生物生長常用的二級模型有修正Ratkowsky模型[16-17]、二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型[18]、Arrhenius模型[9,19]。二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型研究多種因素對微生物生長的影響，其中的參數(shù)沒有明確的物理意義；Arrhenius模型最初是用來表征化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)速率與溫度之間的關(guān)系，有人曾把它引入微生物預(yù)測模型中，但因誤差較大，目前應(yīng)用較少；通常采用修正Ratkowsky模型研究溫度對微生物生長速率的影響。目前，對于新增的食源致病性銅綠假單胞菌在食品中安全預(yù)測的研究鮮見報(bào)道。本研究基于Gompertz模型、修正Ratkowsky模型、Hyperbola模型[20]研究銅綠假單胞菌6～48 ℃的生長情況和生長溫度對銅綠假單胞菌μmax與λ的影響；將μmax與λ的乘積定義為菌體細(xì)胞的初始生理狀態(tài)參數(shù)（h0），研究生長溫度對h0的影響；建立牛乳中銅綠假單胞菌生長的一級預(yù)測模型和生長溫度對μmax、λ影響的二級模型，為牛乳的安全貯藏及控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853購自北京微生物研究所，采用胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入TSB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

TSB培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基 南京丁貝生物科技有限公司；超高溫滅菌全脂牛乳 南京市仙林大學(xué)城蘇果超市；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1300IIA2型生物安全柜 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Scan1200型自動影像分析菌落計(jì)數(shù)儀法國Intersicence公司；UV-9100型紫外分光光度計(jì)美國Beckman公司；ZQTY-70S型大容量低溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；101-3AS電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；精密電子天平 北京塞多利斯天平有限公司；BCD-196T型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同溫度下銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的平板菌落計(jì)數(shù)

將按1.1節(jié)方法制備的ATCC27853菌懸液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于超高溫滅菌全脂牛乳和TSB培養(yǎng)基（對照組）中，使初始菌落數(shù)在102～103CFU/mL范圍內(nèi)，分別置于6、10、16、22、28、36、42、45、48、50 ℃下140 r/min振蕩培養(yǎng)，每個(gè)溫度在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，并在TSA平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。時(shí)間間隔的選取根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)組TSB培養(yǎng)基上ATCC27853的生長情況決定，ATCC27853的生長情況通過紫外分光光度計(jì)測定的吸光度來測定，采用平板菌落記數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[21]，檢測限為1 CFU/mL。牛乳中ATCC27853的生長量表示為每毫升牛乳中活菌數(shù)量的對數(shù)。

1.3.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的一級Gompertz模型的建立

擬合ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48 ℃下的生長曲線，建立ATCC27853在牛乳中生長的一級Gompertz模型，如式（1）所示。

式中：Nt表示在某時(shí)間（t/h）時(shí)ATCC27853菌落數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））；a表示t＝0 h時(shí)ATCC27853菌落數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））；b表示ATCC27853最大菌落數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））；d表示達(dá)到最大生長速率時(shí)所用的時(shí)間（即生長曲線的拐點(diǎn)）/h；c表示ATCC27853在d時(shí)刻的最大生長速率/h-1。

細(xì)菌的μmax和λ是用來描述其生長的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。ATCC27853的μmax、λ與Gompertz模型的相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系分別見式（2）、（3）[22]。

式中：e為自然常數(shù)（2.718 28）。

將式（2）、（3）式代入式（1）中，則Gompertz模型可轉(zhuǎn)化為式（4）。

式中：N0表示t＝0 h時(shí)ATCC27853初始菌落數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））；Nmax表示ATCC27853最大菌落數(shù)的對數(shù)（lg（CFU/mL））。

微生物生長的λ是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后的一段時(shí)間內(nèi)，因代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境的需要，使得核糖體、酶類和ATP等的合成加速、RNA含量增加、新的細(xì)胞成分被合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞體積變大，但這一階段細(xì)胞數(shù)目沒有增加。本研究將這一階段的這種生理、代謝狀態(tài)稱為細(xì)胞的初始生理狀態(tài)，用h0來表示[13]，用來描述細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，h0與λ和μmax的關(guān)系見式（5）[23]。

1.3.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的二級修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的建立

在一級模型的基礎(chǔ)上建立二級模型，研究生長溫度對一級模型參數(shù)的影響。利用修正Ratkowsky模型研究μmax與溫度的關(guān)系，如式（6）所示。

式中：μmax表示在溫度T/℃下的最大比生長速率/h-1；Tmin表示ATCC27853生長代謝活力為零時(shí)的最低溫度/℃；Tmax表示ATCC27853生長代謝活力為零時(shí)的最高溫度/℃；m/（℃-1·h-0.5）、n/℃-1為常數(shù)。

基于Hyperbola模型，將ATCC27853的λ取自然對數(shù)轉(zhuǎn)化成ln λ，研究λ和T之間的關(guān)系，如式（7）所示。

式中：T1表示ATCC27853的最低生長溫度/℃；T2表示當(dāng)生長溫度大于最低生長溫度時(shí)，λ減少的時(shí)間所對應(yīng)的溫度的升高量/℃。

1.3.4 模型的評價(jià)及其驗(yàn)證

采用Matlab 2016b軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行Gompertz模型、修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的建立。模型的評價(jià)采用決定系數(shù)（R2）、均方根誤差（RMSE）、準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）。其中，R2和RMSE表示模型的精確度、可靠性，R2越接近于1，RMSE越小，模型擬合度越高[24-25]。Af用于衡量預(yù)測值與觀測值之間的接近程度：Af越接近于1表示模型的擬合度越高，Af越小表明模型預(yù)測值與實(shí)測值越接近，模型越精確。Bf＞1表示模型預(yù)測值比實(shí)測值高，Bf＜1表示模型預(yù)測值比實(shí)測值低，Bf越接近1表示模型擬合度越高[26]。

模型的驗(yàn)證采用R2、Af和Bf。一級模型的驗(yàn)證：使ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48 ℃下生長，每個(gè)生長溫度取不同于模型建立的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣驗(yàn)證。二級模型的驗(yàn)證：在ATCC27853不同的生長溫度12、19、25、39、44 ℃進(jìn)行取樣，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。R2、RMSE、Af和Bf的計(jì)算見式（8）～（11）。

式中：n表示測定值的個(gè)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理及作圖通過Matlab 2016b軟件，用Gompertz模型擬合銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下的生長曲線，用修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型分別擬合牛乳中ATCC27853的生長溫度對μmax和λ之間的二級模型，計(jì)算各個(gè)參數(shù)值并進(jìn)行多重比較，結(jié)果以表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的建立

圖1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中的Gompertz模型曲線以及失活情況Fig. 1 Gompertz growth curves for P. aeruginosa ATCC27853 in milk and inactivation

由圖1可以看出，除50 ℃外，其余溫度的實(shí)測值皆比較均勻地分布于預(yù)測生長曲線的兩側(cè)，說明利用Gompertz模型能較好地?cái)M合ATCC27853在牛乳中6～48 ℃的生長曲線，從低到高這9 個(gè)溫度下，ATCC27853在牛乳中的生長曲線基本均呈現(xiàn)S形，有延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期3 個(gè)部分。在低溫度下λ較為明顯，如在10 ℃下λ約為25 h；當(dāng)生長溫度超過28 ℃后，λ就變得很短，如在28、36、42 ℃下，僅用約1 h就能進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體能很快適應(yīng)新的環(huán)境。進(jìn)入對數(shù)期后，不同生長溫度下ATCC27853對數(shù)期差異明顯，如6 ℃時(shí)對數(shù)期約100 h，而36 ℃時(shí)只需約10 h，表明ATCC27853在不同溫度下的生長速率不同。進(jìn)入穩(wěn)定期后，在10～42 ℃下，菌體最大生長量為9.25～9.78（lg（CFU/mL）），差異不明顯。在6、45、48 ℃下的菌體最大生長量明顯降低。ATCC27853在50 ℃時(shí)隨著時(shí)間的延長菌落數(shù)降低，到14 h后低于檢測限，說明ATCC27853在50 ℃時(shí)不生長，已經(jīng)失活。綜上，生長溫度是ATCC27853在牛乳中生長繁殖的關(guān)鍵因素。

由表1可以看出，9 個(gè)溫度下a在2.65～3.60（lg（CFU/mL））之間，相差小于1（lg（CFU/mL））。在10～42 ℃時(shí)，ATCC27853的b均可達(dá)到109CFU/mL，表明在10～42 ℃時(shí)ATCC27853所能達(dá)到的最大菌落數(shù)并不隨溫度的變化而變化。當(dāng)溫度為6、45、48 ℃時(shí)，ATCC27853的b分別為7.78、8.85、7.77（lg（CFU/mL）），與10～42 ℃時(shí)相比差異顯著（P＜0.05），菌體的生長受到明顯的抑制。6～48 ℃時(shí)，c隨溫度的升高先增大后減小，36 ℃時(shí)c最大。d隨溫度的升高呈先縮短再延長的趨勢，從172.95 h縮短到4.77 h再延長到25.60 h，36 ℃時(shí)d最短。

表1 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中于不同溫度下生長的一級Gompertz模型參數(shù)值Table 1 Estimated parameter values in Gompertz growth curves for P. aeruginosa ATCC27853 in milk at different temperatures

在6～36 ℃的生長溫度范圍內(nèi)，μmax由0.017 8增長到0.641 3，因?yàn)殡S著溫度的升高，ATCC27853的代謝反應(yīng)及生長速率在加快，最適生長溫度36 ℃也是該菌生長速率最快的溫度；當(dāng)生長溫度為48 ℃時(shí)，μmax顯著降低到0.190 6（P＜0.05）。生長溫度上升到50 ℃時(shí)，可能是因?yàn)锳TCC27853菌體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等熱敏性大分子物質(zhì)在高溫下發(fā)生變性，細(xì)胞的生理代謝功能急劇下降，菌體死亡；對應(yīng)的λ也發(fā)生相應(yīng)的變化，從86.88 h縮短到1.41 h，之后又延長到15.71 h，ATCC27853在最適生長溫度36 ℃時(shí)λ最短。牛乳在貯藏期間，一旦由微生物引起腐敗變質(zhì)，微生物的λ與其貨架期有關(guān)，λ越長貨架期越長；在較低溫度和較高溫度下微生物的λ較長，會延長牛乳的貨架期。ATCC27853細(xì)胞的h0描述了細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，h0越高細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的能力越弱。由表1可以看出，溫度為6、10、48 ℃時(shí)的h0比較高；16～45 ℃時(shí)h0基本保持不變，且差異不顯著（P＞0.05）。此外，50 ℃與6～48 ℃菌體的初始菌落數(shù)基本相同，50 ℃下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，ATCC27853菌體細(xì)胞不能忍受此高溫，數(shù)量呈下降趨勢，并于14 h后低于檢測線，表明ATCC27853菌體死亡。

員工當(dāng)月工資薪金所得低于稅法規(guī)定的費(fèi)用扣除額，適用公式：應(yīng)納稅額＝（員工當(dāng)月取得全年一次性獎金－員工當(dāng)月工資薪金所得與費(fèi)用扣除額的差額）×適用稅率－速算扣除數(shù)。

2.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的評價(jià)

由表2可知，在6～4 8 ℃時(shí)，模型的RMSE≤0.219 2，R2≥0.991 9，說明模型擬合效果較好。Af和Bf皆接近于1，也表明該模型的擬合度較好，ATCC27853的一級Gompertz模型的預(yù)測值與實(shí)測值之間偏差很小，基本沒有系統(tǒng)偏差，不會產(chǎn)生安全性危害的情況。Ross等[27]認(rèn)為Bf在0.90～1.05的范圍內(nèi)時(shí)模型擬合好；Bf在0.70～0.90與1.06～1.15之間模型擬合效果可以接受；Bf＜0.70或Bf＞1.15時(shí)，存在系統(tǒng)偏差，模型擬合不可接受。綜上，本研究建立的一級Gompertz模型能很好地預(yù)測ATCC27853在牛乳中6～48 ℃下的生長，擬合效果好，且有效、可靠。

表2 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的Gompertz模型的評價(jià)結(jié)果Table 2 Fitness evaluation of Gompertz model for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

2.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中一級Gompertz模型的驗(yàn)證

利用Matlab軟件對表3中實(shí)測值及一級模型的預(yù)測值進(jìn)行相關(guān)性分析，R2＝0.993 6，Af＝1.018 2，Bf＝0.999 6，也表明Gompertz模型的有效性，可以利用Gompertz模型對牛乳中的ATCC27853生長進(jìn)行預(yù)測。

表3 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的Gompertz模型的驗(yàn)證Table 3 Validation of Gompertz model for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

2.4 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的建立

圖2 牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853生長溫度對μmax的影響Fig. 2 Effect of growth temperature on the maximum specific growth rate of P. aeruginosa ATCC27853 in milk

為了進(jìn)一步了解溫度對牛乳中ATCC27853生長速率的影響，基于2.1節(jié)建立的一級Gompertz模型，利用修正Ratkowsky模型研究生長溫度對μmax的影響。由圖2可知，隨著溫度的升高，ATCC27853的μmax逐漸增加，直至最適生長溫度36 ℃；當(dāng)溫度超過36 ℃后μmax開始下降直至為零。微生物生長的λ是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后，最初一段時(shí)間要適應(yīng)新環(huán)境，一時(shí)還缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或者足夠的中間代謝物，其細(xì)胞數(shù)目不會發(fā)生變化，但對于不同的生長溫度這個(gè)適應(yīng)期是不相同的。由圖3可知，隨著生長溫度的升高，ATCC27853的λ逐漸縮短，lnλ縮短，說明隨著生長溫度的升高，ATCC27853細(xì)胞的代謝系統(tǒng)適應(yīng)溫度變化的時(shí)間在縮短。但是，當(dāng)溫度升到48 ℃后，λ明顯延長，Hyperbola模型不再適合擬合生長溫度與lnλ的關(guān)系。

圖3 牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853生長溫度對λ的影響Fig. 3 Effect of growth temperature on the lag phase duration of P. aeruginosa ATCC27853 in milk

表4 二級模型參數(shù)的估計(jì)值和95%置信區(qū)間值Table 4 Estimates and 95% confidence level of parameters in secondary model

如表4所示，TCC27853的修正Ratkowsky模型中Tmin為1.8 ℃，Tmax為48.8 ℃，可為該菌在牛乳中的安全控制提供理論依據(jù)。ATCC27853的Hyperbola模型中T1為0.7 ℃，是ATCC27853的生長最低溫度；參數(shù)Tmin和T1皆表示理論最低生長溫度，實(shí)驗(yàn)表明ATCC27853在4 ℃下不生長（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未顯示），修正Ratkowsky模型中最低溫度的理論值與實(shí)際值更接近，而Hyperbola模型擬合的最低溫度略低于實(shí)際情況；利用Hyperbola模型，能夠快速預(yù)測牛乳的安全貯存時(shí)間，確定其貨架期。

2.5 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的評價(jià)

修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型的評價(jià)結(jié)果為：RMSE≤0.256 7，R2≥0.974 1，1.087 0≤Af≤1.152 0，1.052 8≤Bf≤1.0721，R2、Af和Bf皆接近于1，說明二級模型擬合度較好。

2.6 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長二級模型的驗(yàn)證

表5 銅綠假單胞菌ATCC27853在牛乳中生長的二級模型的驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Validation of secondary models for P. aeruginosa ATCC27853 growth in milk

如表5所示，利用Matlab軟件將實(shí)驗(yàn)所得μmax的實(shí)測值與修正Ratkowsky模型的預(yù)測值進(jìn)行相關(guān)性分析，R2＝0.996 5，Af＝1.052 8，Bf＝1.021 2。對lnλ的實(shí)測值與Hyperbola模型預(yù)測值的相關(guān)性進(jìn)行分析，R2＝0.992 5，Af＝1.058 1，Bf＝0.988 5。表明本研究所建立的二級修正Ratkowsky模型和Hyperbola模型是有效且可靠的。

3 討 論

牛乳的營養(yǎng)價(jià)值較高，在加工、運(yùn)輸、貯藏和銷售的過程中微生物對其污染是很難避免的，極易因污染銅綠假單胞菌而引起腐敗變質(zhì)。本研究建立了6～48 ℃下ATCC27853在牛乳中生長的一級和二級模型，發(fā)現(xiàn)ATCC27853能在6 ℃的低溫下生長，最高生長溫度為48 ℃；研究了牛乳中溫度對ATCC27853生長的影響及預(yù)測，為其安全貯藏及控制提供理論依據(jù)。

本研究首先利用Gompertz模型建立了ATCC27853的一級生長模型，基于一級生長模型的參數(shù)，再結(jié)合修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型，分別建立了ATCC27853的μmax、λ與生長溫度之間的二級模型。發(fā)現(xiàn)修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型能分別較好地建立ATCC27853在牛乳中生長溫度與μmax、生長溫度與λ的關(guān)系。

由h0可以確定ATCC27853的初始生理狀態(tài)[25]。Baranyi[28]、Gospavic[23]和Velugoti[29]等的研究認(rèn)為不同溫度下菌體細(xì)胞的h0基本保持恒定。Mellefont等[30]在研究生長溫度對大腸桿菌和克雷伯氏菌的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，h0不是恒定不變的，溫度的變化還會影響λ；Delignette-Muller等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特氏菌接種前的培養(yǎng)溫度與接種后生長溫度的變化幅度與h0有一定的相關(guān)性；Xanthiakos等[25]研究了1.5～16 ℃下單增李斯特氏菌的生長情況，發(fā)現(xiàn)在1.5～8.0 ℃下h0明顯高于在8～16 ℃。

在ATCC27853的初始菌量基本相同的情況下，本研究發(fā)現(xiàn)在16～45 ℃的范圍內(nèi)，牛乳中ATCC27853菌體h0基本保持恒定，隨溫度變化h0變化不顯著（P＞0.05），這與Gospavic等[23]的研究結(jié)果一致；在6 ℃和10 ℃時(shí)，h0明顯高于16～45 ℃，此結(jié)果與Xanthiakos等[25]的研究結(jié)果相似，原因可能是低溫（6 ℃和10 ℃）限制了菌體細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等大分子物質(zhì)的合成。

Baranyi等[28]的研究認(rèn)為h0＝μmax×λ、α0＝exp（-h0）。當(dāng)ATCC27853的生長溫度在16 ℃時(shí)h0＝1.017 9（表1），則α0＝36.14%，表明在此溫度下ATCC27853菌體細(xì)胞的比生長速率為μmax的36.14%；在16～45 ℃時(shí)α0平均值約為40.11%，6、10、48 ℃時(shí)α0分別為21.22%、23.91%和5.01%，可以看出6、10、48 ℃的α0明顯低于16～45 ℃。生長溫度為6、10、48 ℃時(shí)生長速率明顯較低，推測可能是ATCC27853接種前的培養(yǎng)溫度（36 ℃）與被接種后的生長溫度（6、10、48 ℃）之間存在較大的差異，導(dǎo)致h0較大的改變，生長溫度對初始生理狀態(tài)的影響為預(yù)測微生物生長研究提供理論依據(jù)。

綜上，本研究采用Gompertz模型建立了6～48 ℃下牛乳中銅綠假單胞菌ATCC27853的一級生長模型，結(jié)合修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型分別建立了ATCC27853的生長溫度對其μmax和λ影響的二級模型；用R2、RMSE、Af和Bf評價(jià)模型擬合并驗(yàn)證模型的有效性和可靠性，結(jié)果表明：用Gompertz模型、修正Ratkowsky模型與Hyperbola模型建立的一級生長模型和二級模型擬合度高；ATCC27853的生長溫度對h0的影響表明菌株培養(yǎng)溫度（36 ℃）與被接種后的生長溫度（6、10、48 ℃）之間存在較大的差異時(shí)會導(dǎo)致h0發(fā)生較大的改變。ATCC27853生長溫度對μmax、λ和h0影響的預(yù)測模型的建立為其在牛乳中的安全控制提供理論依據(jù)。