胡曉紅，柏華，段娟娟 ，雷秀 ，張啟芳

0 引言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其中20%~25%乳腺癌患者攜帶過表達(dá)表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor 2,HER2）[1-2]。 HER2過表達(dá)預(yù)示著患者易有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化差、無疾病總體生存期短[3]。靶向HER2陽性的藥物，例如人源化曲妥珠單抗和雙重HER2-EGFR酪氨酸激酶抑制劑拉帕替尼，可使HER2陽性乳腺癌患者的臨床結(jié)果得到顯著改善[4-6]。但是，患者對兩種藥物產(chǎn)生耐藥性是治療HER2陽性乳腺癌面臨的巨大挑戰(zhàn)，大約50%的HER2陽性患者在治療一年后表現(xiàn)出對曲妥珠單抗的抗藥性[7]。拉帕替尼在接受過曲妥珠單抗治療失敗的晚期轉(zhuǎn)移性HER2陽性乳腺癌中取得了較好的臨床療效， 然而，只有不到25%達(dá)到一定療效，其中大部分最終會產(chǎn)生獲得性耐藥[8-9]。因此，這些抗性產(chǎn)生的機制仍然是臨床上尚未解決的重要問題。

本研究中，我們用HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株BT-474建立拉帕替尼耐藥細(xì)胞株，檢測拉帕替尼誘導(dǎo)分泌的白介素-6（Interleukin-6, IL-6） 在拉帕替尼耐藥中的作用，旨在探討靶向治療HER2陽性乳腺癌的耐藥機制，為突破耐藥提供可能的新靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人乳腺癌BT-474細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，RPMI培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清（美國Gibco公司）以及1%青霉素和鏈霉素雙抗Antibiotic-Antimycotic（美國Gibco公司），置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

拉帕替尼購自美國MedchemExpress（MCE）公司, 人源IL-6R ELISA和MTT檢測試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific公司，Caspase 3/7Glo購自美國Promega公司，RNeasy Plus kit購自德國Qiagen公司，cDNA合成試劑盒（iScript）購自美國Bio-Rad公司。P-gp、兔抗STAT3、兔抗P-STAT3，兔抗Cleaved caspase-3、兔抗TUBULIN、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、兔抗羊二抗均購自美國CST公司。

1.3 MTT檢測細(xì)胞IC50

調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度，以5×103個/孔的密度分別將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔加200 μl完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天用DMSO或拉帕替尼處理。處理48 h后，每孔細(xì)胞加入12 mmol/L MTT液10 μl，連續(xù)孵育4 h，停止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，避光搖晃，酶標(biāo)檢測儀測定540 nm處的吸光度值。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率=（1-加藥組OD值/對照組OD值）×100%。

1.4 拉帕替尼耐藥細(xì)胞株的建立

用0.2、0.5、1.0、2.0 μmol/L拉帕替尼逐漸遞增濃度直至4.0 μmol/L處理細(xì)胞加以誘導(dǎo)，維持6月，建立穩(wěn)定BT-474耐藥株（BT-474R）。Western blot法檢測耐藥標(biāo)志蛋白P-gp的表達(dá)。用MTT法檢測BT-474R細(xì)胞的生長抑制IC50值。用Caspase-Glo?3/7法驗證拉帕替尼誘導(dǎo)的Caspase3/7酶的活性在BT-474R細(xì)胞是否比在BT-474細(xì)胞降低。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

收集細(xì)胞，提取總蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白, 將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉，常規(guī)一抗和二抗孵育后, 用ECL超敏免疫印跡檢測試劑（英國Amersham公司）檢測蛋白表達(dá)，用Image J軟件分析蛋白圖像強度。

1.6 Caspase-Glo? 3/7法檢測細(xì)胞凋亡

把16 000個細(xì)胞（100 μl）接種于96孔不透明白板，按實驗方案加入DMSO或拉帕替尼處理6 h。不含細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品吸收值作為背景值。DMSO處理的細(xì)胞樣品作為陰性對照。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用藥細(xì)胞處理到達(dá)時間時，取出96孔板，平衡至室溫。每孔加入100 μl Caspase-Glo?3/7試劑，混勻，室溫孵育90 min。采用具備熒光檢測功能的讀板機讀取熒光值。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選取對數(shù)生長期的乳腺癌BT-474細(xì)胞株，懸浮在無抗生素的培養(yǎng)液里，按1×106個細(xì)胞接種10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜。制備終濃度為50 nmol/L的siSTAT3或siScr。 用無血清OPTI-MEM分別稀釋siSTAT3、siScr和Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，室溫靜置5 min后混合，逐滴加入待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。 轉(zhuǎn)染12 h后換新鮮培養(yǎng)基。Western blot檢測基因沉默效率。Stat3 siRNA（siSTAT3）正義鏈為：5′-GGAAGCUGCAGAAAGAUACGACUGA 3′, 陰性siRNA (siScr) 正義鏈為：5′-CUGCUAUCACCGACAGCUAAGGGAC-3′。

1.8 qPCR檢測IL-6 mRNA的表達(dá)

用RNeasy試劑抽提細(xì)胞總RNA，按iScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用Sybr Green分別進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。人IL-6引物：上游為5′-CCAGGAGCCCAGCTATGAAC-3′，下游為5′-GATGCCGTCGAGGATGTACC-3′，擴增片段長度為206 bp；β-actin內(nèi)參引物為：上游引物5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA GTG-3′，擴增片段長度為179 bp；人IL-6R引物：上游引物為5′-TGAGCTCAGATATCGGGCTGAAC-3′，下游引物為5′-CGTCGTGGATGACACAGTGATG-3′。

反應(yīng)條件為：95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。采集待測基因和內(nèi)參（β-actin） , 計算ΔΔCt及相對含量（RQ），RQ=2-ΔΔCt。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用siSTAT3或siScr轉(zhuǎn)染BT-474R細(xì)胞6 h后，用DMSO或拉帕替尼處理細(xì)胞48 h，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h，收集細(xì)胞后用Annexin V-FITC/PI雙染色法凋亡試劑盒（eBioscience）檢測細(xì)胞凋亡，按使用說明書操作。樣品準(zhǔn)備好后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，數(shù)據(jù)用FlowJo軟件處理。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0自帶統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，每組實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組之間的數(shù)據(jù)采用t檢驗, 多組間的單變量比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 拉帕替尼耐藥細(xì)胞株BT-474R的鑒定

Western blot結(jié)果顯示，BT-474R細(xì)胞中P-gp的表達(dá)比BT-474顯著增加，見圖1A。用MTT法檢測BT-474細(xì)胞的IC50大約是0.22 μmol/L, 而BT-474R細(xì)胞的IC50大約是2.8 μmol/L，即BT-474R細(xì)胞IC50是BT-474細(xì)胞的12.7倍，見圖1B。Caspase Glo?3/7法顯示BT-474R細(xì)胞中拉帕替尼誘導(dǎo)的Caspase3/7酶的活性比BT-474細(xì)胞顯著降低，見圖1C。以上結(jié)果說明BT-474R細(xì)胞具有拉帕替尼耐藥性。

2.2 拉帕替尼對STAT3活性的影響

Western blot結(jié)果顯示，拉帕替尼能上調(diào)p-STAT3水平，即增強STAT3活性，見圖2A。在BT-474R細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)比BT-474細(xì)胞顯著升高，見圖2B。由此說明拉帕替尼增強STAT3活性。

2.3 抑制STAT3表達(dá)對Caspase 3/7活性的影響

圖1 拉帕替尼耐藥細(xì)胞株BT-474R的構(gòu)建Figure1 Establishment of lapatinib-resistant BT-474 cell line (BT-474R)

圖2 拉帕替尼誘導(dǎo)STAT3活性Figure2 Lapatinib treatment induced STAT3 activity

Western blot結(jié)果顯示，siSTAT3有效地沉默了STAT3表達(dá)，見圖3A。用DMSO或拉帕替尼處理BT-474R細(xì)胞24 h后，用Western blot檢測細(xì)胞凋亡標(biāo)志產(chǎn)物Cleaved Caspase 3的表達(dá)水平，沉默STAT3后，BT-474R細(xì)胞中拉帕替尼誘導(dǎo)的Cleaved Caspase 3的表達(dá)水平顯著高于未沉默組（siScr），見圖3B。用Caspase Glo?3/7法結(jié)果顯示：沉默STAT3后，BT-474R中拉帕替尼誘導(dǎo)的Caspase 3/7的表達(dá)水平顯著高于未沉默組（siScr），見圖3C。這些結(jié)果說明BT-474R細(xì)胞對拉帕替尼的耐藥性依賴STAT3活性。

2.4 沉默STAT3對拉帕替尼誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，拉帕替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率在STAT3沉默組為33.42%，在未沉默組（siScr）組細(xì)胞為18.52%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖4A。Western blot檢測結(jié)果表明沉默STAT3后顯著抑制耐藥基因P-gp表達(dá)，見圖4B。

2.5 拉帕替尼通過刺激乳腺癌細(xì)胞分泌IL-6對STAT3活性的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示，拉帕替尼顯著誘導(dǎo)了BT-474細(xì)胞的IL-6 mRNA 表達(dá)，見圖5A。Western blot檢測結(jié)果表明BT-474R細(xì)胞的IL-6蛋白表達(dá)水平顯著高于BT-474細(xì)胞，見圖5B。與BT-474細(xì)胞相比，qPCR檢測結(jié)果顯示拉帕替尼沒有顯著誘導(dǎo)BT-474R細(xì)胞中IL-6R mRNA的表達(dá)，見圖5C。Western blot檢測上清液中IL-6表達(dá)，BT-474+DMSO作為陰性對照，BT-474+Lapatinib作為陽性對照，結(jié)果表明BT-474R細(xì)胞分泌IL-6蛋白，見圖5D。

用IgG或IL-6抗體預(yù)處理BT-474細(xì)胞，然后用拉帕替尼處理BT-474細(xì)胞后的上清液（CM）刺激BT-474細(xì)胞，Western blot檢測結(jié)果顯示，IL-6抗體組沒有刺激STAT3活性， 這個結(jié)果說明IL-6抗體中和上清液的IL-6，導(dǎo)致STAT3沒有被激活，見圖5E。這些結(jié)果表明拉帕替尼誘導(dǎo)的IL-6分泌刺激STAT3活性，增強了BT-474細(xì)胞耐藥性。

圖3 抑制STAT3表達(dá)對拉帕替尼誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞裂解的Caspase 3和Caspase3/7活性的作用Figure3 STAT3 silencing enhanced lapatinib-mediated cleavage Caspase 3 and Caspase 3/7 activity

圖4 STAT3表達(dá)對拉帕替尼誘導(dǎo)耐藥乳腺癌BT-474細(xì)胞凋亡的調(diào)控Figure4 STAT3 expression mediated lapatinib-induced apoptosis of breast cancer BT-474 cells

圖5 拉帕替尼通過刺激乳腺癌細(xì)胞分泌IL-6影響STAT3的活性Figure5 Lapatinib stimulated STAT3 activity via IL-6 signaling

3 討論

拉帕替尼是靶向HER2陽性癌癥的第二代靶向藥物，但患者對其產(chǎn)生的耐藥阻礙了它的療效。研究顯示拉帕替尼會激活一些信號通路，包括PI3K/AKT/mTOR、Ras/ERK和HER2通路，由此引起拉帕替尼耐藥[10-11]。拉帕替尼能上調(diào)耐藥蛋白P-gp的表達(dá)。雖然拉帕替尼能有效抑制HER2活性，但是最近用拉帕替尼單藥治療癌癥的臨床試驗也宣告失敗，其原因是拉帕替尼誘導(dǎo)HER2與HER3形成持續(xù)激活的異聚體，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長[12]。在靶向EGFR、ERK治療中，反饋信號激活促癌基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）是靶向耐藥的主要原因[13-14]。 在EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，酪氨酸激酶抑制劑埃洛替尼誘導(dǎo)持續(xù)性激活STAT3[15]。

雖然拉帕替尼自身能抑制HER2活性，但最新研究發(fā)現(xiàn)拉帕替尼也會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長， 原因可能是拉帕替尼誘導(dǎo)了HER2與HER3形成持續(xù)激活的異聚體[13]。拉帕替尼耐藥機制有待研究。本研究發(fā)現(xiàn)拉帕替尼通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子IL-6激活STAT3，引起細(xì)胞耐藥。

我們首先建立了拉帕替尼耐藥細(xì)胞株BT-474R。通過檢測證實了BT-474R細(xì)胞株高表達(dá)耐藥標(biāo)志蛋白P-gp，IC50是BT-474的12.7倍，拉帕替尼誘導(dǎo)的Caspase3/7活性在BT-474R顯著低于親本細(xì)胞，說明BT-474R是耐藥細(xì)胞。

因為STAT3在許多腫瘤、耐藥細(xì)胞株，包括一些靶向耐藥細(xì)胞中處于持續(xù)性激活狀態(tài)， 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、促血管生成等。在攜帶EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，酪氨酸激酶抑制劑埃洛替尼誘導(dǎo)STAT3持續(xù)性激活[15]。因此本實驗檢測了拉帕替尼是否能增強STAT3的活性。結(jié)果顯示，拉帕替尼可以誘導(dǎo)STAT3活性，在BT-474R中，我們觀察到隨著時間的推移拉帕替尼逐漸增加STAT3活性，表明反饋機制可能是STAT3持續(xù)激活的基礎(chǔ)。

為了探究STAT3表達(dá)是否有助于提高拉帕替尼抗性，我們在BT-474R細(xì)胞中沉默STAT3基因，顯著增加了拉帕替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved Caspase 3表達(dá)和Caspase3/7的活性，說明拉帕替尼耐藥依賴STAT3表達(dá)，STAT3的反饋激活有助于耐藥性的出現(xiàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果也顯示STAT3基因沉默增強了拉帕替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

與我們這些結(jié)果類似，在HER2陽性乳腺癌和胃癌中，曲妥珠單抗耐藥與由上游纖連蛋白/EGF /IL-6誘導(dǎo)的以STAT3為中心的正反饋環(huán)機制相關(guān)[14]；對非小細(xì)胞肺癌耐藥機制的研究也清楚地證明，抑制各種絡(luò)氨酸激酶受體，包括EGFR、絲裂原活化蛋白激酶激酶MEK、FGFR和HER2，可以觸發(fā)STAT3的反饋激活[15]。

為了進(jìn)一步探索STAT3反饋激活的機制, 對拉帕替尼調(diào)控的可激活STAT3的候選上游激活因子進(jìn)行了理論篩選。在HER2陽性乳腺癌中，IL-6可誘導(dǎo)耐藥的發(fā)生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長及反饋激活STAT3，因此我們認(rèn)為IL-6是最可能的候選因子。IL-6或其受體的表達(dá)升高常見于許多癌癥類型，并且與預(yù)后不良有關(guān)[16-17]。此外，IL-6表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對抗癌療法具有抗性[18-19]。Hartman等報道HER2過表達(dá)增強IL-6轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致IL-6/JAK/STAT3自分泌環(huán)的激活，這在HER2陽性乳腺癌的發(fā)生中起關(guān)鍵作用[20]。因此我們檢測了拉帕替尼是否能刺激IL-6的表達(dá)和分泌，結(jié)果顯示拉帕替尼的確能夠誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)和分泌，來自拉帕替尼處理的細(xì)胞上清液可以激活BT-474細(xì)胞STAT3活性，而用IL-6抗體中和拉帕替尼誘導(dǎo)分泌的IL-6上清液，不能激活BT-474細(xì)胞STAT3活性，說明拉帕替尼耐藥中增強的STAT3活性是通過拉帕替尼分泌的IL-6反饋機制調(diào)控的。最近一項研究成果與我們的結(jié)果一致，IL-6調(diào)控HER2陽性乳腺癌拉帕替尼耐藥，他們發(fā)現(xiàn)IL-6通過維持HER2陽性乳腺癌干細(xì)胞引起對拉帕替尼耐藥[21]。除此之外，有研究已經(jīng)證實IL-6R也參與激活STAT3促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展及化療耐受[22-23], 但我們的結(jié)果顯示拉帕替尼沒有顯著上調(diào)BT474細(xì)胞IL-6R的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為拉帕替尼是通過誘導(dǎo)IL-6表達(dá)激活STAT3的活性。

綜上所述，抑制IL-6/STAT3信號通路可抑制HER2陽性乳腺癌拉帕替尼耐藥。鑒于STAT3是調(diào)控多個腫瘤細(xì)胞生存、增殖、抗凋亡、血管生成和耐藥等信號通路的樞紐和轉(zhuǎn)錄因子[24]，至今沒有非常有效的。方法抑制STAT3表達(dá)，研究IL-6/STAT3信號通路中可駕馭的因子，有望為HER2陽性乳腺癌拉帕替尼耐藥提供新的思路和靶點。