梁皓，肖向茜，盛望

北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

2017年是嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法的突破元年，先后有2 款CAR-T 細胞療法經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市，用于急性淋巴細胞白血病和復發(fā)性或難治性大B 細胞淋巴瘤[1-2]。雖然CAR-T 細胞有良好的應用前景，但同時存在許多不足之處。自然殺傷（natural killer，NK）細胞作為另一種重要的腫瘤殺傷性免疫細胞，在CAR的應用中具有T 細胞沒有的一些優(yōu)勢：異體NK 細胞不會引起移植物抗宿主反應（graft-versus-host disease，GVHD），并已在許多臨床試驗中得到證實[3-4]；NK 細胞不分泌引起細胞因子釋放綜合征的炎癥因子，如IL-1、IL-6等[5]；CAR-NK 細胞除了CAR 介導的靶向殺傷之外，還可以通過NK 細胞自身抗腫瘤的特性，識別并殺傷CAR 靶標下調(diào)或缺失的腫瘤細胞，提高免疫治療效果[6]；NK 細胞來源豐富，包括外周血（peripheral blood，PB）、臍帶血（umbilical cord blood，UCB）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPCS）、NK-92 等細胞系[7-9]，使其能成為一種“現(xiàn)貨（off the shelf）”細胞產(chǎn)品。在此，我們簡要綜述近年來CARNK 細胞在免疫治療中的進展。

1 NK細胞簡介

NK 細胞占外周血淋巴細胞的10%～15%[10]，根據(jù)CD16 與CD56的表達情況可分為CD56brightCD16-和CD56dimCD16+等 2 種 NK 細胞[11]，它們在表型、組織分布和免疫效果上各不相同。CD56dim細胞在外周血中占NK 細胞總量的90%，它們是完全成熟的NK 細胞，在免疫殺傷中占主導地位。由于CD56dim細胞表達Fcγ受體CD16，它可以發(fā)揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[12]。與之相比，CD56bright細胞未完全成熟，它們主要負責細胞因子的分泌，具有較弱的細胞毒性。CD56bright細胞在外周血中含量較少，在二級淋巴器官中含量較高，說明可能具有更好的滲透性，易于穿過血管到達組織中[13]。

2 NK細胞的來源

用于臨床治療的NK 細胞有多種來源，盡管自體NK 細胞可應用于細胞過繼治療中，但它在臨床中治療腫瘤的效果有限[14]，所以CAR 應用于異體來源的NK 細胞中會更有前景。異體NK 細胞的來源包括外周血、NK 細胞系、臍帶血、誘導多能干細胞等（表1）。

2.1 外周血

NK 細胞可以從人的外周血中通過血漿分離置換法分離出來[15]，由于其在外周血中所占比例較低，通常需要在體外擴增以達到臨床使用的數(shù)量。通過添加IL-2 和飼養(yǎng)細胞（提前輻照過的轉(zhuǎn)染EB 病毒的淋巴細胞系），NK 細胞得到大量擴增[16]。另一種方法是用轉(zhuǎn)染4-1BB 配體和mbIL-15的HLA 缺陷型K562 細胞作為飼養(yǎng)細胞在體外擴增NK 細胞[17]。飼養(yǎng)細胞的存在可能會增加NK 細胞在臨床中的副作用[18]，所以無飼養(yǎng)細胞的擴增技術相繼發(fā)展。Wagner 等利用兩步法技術，在IL-15 和IL-21的幫助下得到大量具有殺傷活性的NK 細胞[19]。

目前已有多項關于外周血來源的CAR-NK 細胞用于癌癥免疫治療的研究，其中靶向CD19 最為突出，修飾后的CAR-NK 細胞在急性B 淋巴細胞白血病的治療中具有十分理想的療效[29-30]。對于實體瘤的治療，研究人員開發(fā)了多種靶向腫瘤相關抗原的 CAR-NK 細胞，如靶向 GD2、EGFR 和PSCA 等[29-31]。經(jīng)過 CAR 修飾后的 NK 細胞對表達相應抗原的靶細胞展現(xiàn)出更強的細胞毒作用。其中，最為特別的是以NKG2D 作為胞外域的CAR結(jié)構(gòu)[32]，NKG2D 可以與多種腫瘤表面的配體結(jié)合，有廣譜抗癌效果，NKG2D-DAP10-CD3ζ構(gòu)建的CAR-NK 細胞對于骨肉瘤、前列腺癌、橫紋肌瘤等腫瘤有著良好的殺傷效果。

2.2 NK細胞系

與外周血來源的NK 細胞相比，NK 細胞系具有許多優(yōu)勢，便捷的擴增方式和均一的表型使其最有希望成為“現(xiàn)貨”細胞產(chǎn)品。目前已建立了多種NK細胞系，如NK-92、YTS、KHYG-1 等，其中對NK-92細胞的研究最為廣泛。NK-92 細胞是1992年從一位非霍奇金淋巴瘤病人體內(nèi)分離得到的[39]，表型為CD56brightCD16-NKG2A+KIR-（除 KIR2DL4）[40-41]。臨床試驗證明NK-92 細胞具有良好的生物安全性，即使病人注射了1010/m2的NK-92 細胞，仍未觀察到明顯的副作用[42-44]。NK-92 細胞是目前惟一被FDA 批準用于臨床治療的NK 細胞系，但臨床療效有限，所以導入CAR 提高NK-92 細胞的治療效果十分必要。近幾年，不同研究組用NK-92 細胞表達多種CAR 用于白血病與實體瘤的研究[33-38]，如靶向CD19的細胞用于治療淋巴瘤和白血病，靶向CS-1的細胞用于治療多發(fā)性骨髓瘤，靶向EGFR的細胞用于治療神經(jīng)母細胞瘤，靶向EpCAM的細胞用于治療乳腺癌，靶向GPC3的細胞用于治療肝細胞癌等。盡管NK-92 細胞吸引了很多研究者的目光，其自身也存在諸多缺點。由于NK-92 細胞來源于非霍奇金淋巴瘤病人，為了安全性考慮，在臨床應用中NK-92 細胞須提前接受輻射照射，因此大大降低了其在體內(nèi)的持續(xù)性與有效性[45]。同時，NK-92 細胞激活與增殖需要依賴IL-2，在臨床應用中系統(tǒng)性的IL-2 給藥有很嚴重的副作用，并且會激活免疫抑制信號[46]。此外，NK-92 細胞表面缺乏多種激活性受體，如NKp44和NKp46，且不表達CD16，無法引起ADCC[47]。

2.3 臍帶血

臍帶血來源的NK 細胞復蘇后即可使用，無須考慮如NK 細胞系所存在的安全性隱患，使它同樣擁有成為一種“現(xiàn)貨”細胞產(chǎn)品的潛力。臍帶血中的NK 細胞比列（15%～20%）與NK 細胞在外周血中的比例類似[48]，由于一份臍帶血的容量較少，使得從中獲得足夠數(shù)量的NK 細胞用于臨床治療成為一項難題。靜息狀態(tài)的臍帶血NK 細胞表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，其表面高表達抑制性受體NKG2A 并低表達激活性受體如 NKp46、NKG2C 和DNAM-1 等[49]。為了克服這些缺陷，Shah 等使用細胞膜表面表達IL-21 和4-1BB 配體的GMP 級K562 細胞作為人工提呈細胞，使一份臍帶血可以產(chǎn)生足夠臨床免疫治療的NK 細胞用量[50]。通過體外激活，臍帶血NK 細胞最終可以表達出完整的激活性受體與抑制性受體，達到與外周血中NK 細胞相似的細胞毒性[51-52]。

2.4 誘導多能干細胞

iPSC 衍生出的NK 細胞同時擁有外周血NK細胞和NK 細胞系的優(yōu)點，它不僅性質(zhì)均一可以大量擴增，而且無須輻照即可注入體內(nèi)。iPSC 可以輕易地從皮膚或外周血中獲取，一旦轉(zhuǎn)化后便可在體外無限擴增[53]。目前的證據(jù)表明，對于卵巢癌細胞系 MA148 和 A1847，iPSC-NK 細胞比外周血NK 細胞展現(xiàn)了更強的細胞毒作用[54]。CAR-iPSC-NK 已在動物實驗中被證實可行，并顯示出很好的腫瘤清除效果[38]。

3 CAR-NK細胞在臨床治療中的應用

目前已有14 項關于CAR-NK的臨床試驗，其中中國 5 項、美國 3 項、新加坡 1 項、德國 1 項，Allife 醫(yī)藥科學技術有限公司資助的4 項臨床試驗處于早期Ⅰ期，未提供相關的詳細資料，無法統(tǒng)計（未列出）。這些臨床試驗多集中于血液腫瘤研究，占9 項，剩余6 項嘗試解決CAR-T 未能解決的實體瘤。圣猶德兒童研究醫(yī)院完成了第一個關于CAR-NK的臨床Ⅰ期試驗（NCT00995137），這項研究使用靶向CD19的CAR-NK 細胞治療B 系急性淋巴細胞白血病。NK細胞來源于供者外周血，表達IL-15 和4-1BB 膜結(jié)合配體的K562 細胞系經(jīng)輻照后作為飼養(yǎng)細胞擴增PB-NK細胞。隨后在NK細胞中導入CAR結(jié)構(gòu)（Anti-CD19+4-1BB+CD3ζ），再將其注射到病人體內(nèi)，目前相關試驗結(jié)果尚未公開。在另一項使用PB-NK的研究中（NCT03415100），廣譜性 CAR-NK（靶向NKG2D 配體）首次應用于臨床，用于治療多種轉(zhuǎn)移性實體瘤。使用NK-92 細胞系與臍帶血來源NK 細胞的臨床試驗也在同步展開。博生吉醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司是中國最早使用NK-92 細胞進行CARNK 研究的機構(gòu)，目前有4 項分別靶向CD19、CD7、CD33 和MUC1的臨床試驗正在開展。MD 安德森癌癥中心開展2 項臍帶血來源的CAR-NK 細胞用于治療B 細胞淋巴瘤。2 項試驗的區(qū)別在于是否伴隨高劑量化療與骨髓移植，使用的CAR 結(jié)構(gòu)是相同的。他們不僅導入了包含Anti-CD19+CD28+CD3ζ的CAR結(jié)構(gòu)，還導入了作為自殺基因的iCasp9 與增強NK細胞活性的IL-15 基因。CAR-NK 細胞臨床試驗匯總見表2。

表2 CAR-NK細胞臨床試驗

4 CAR-NK細胞存在的挑戰(zhàn)

盡管CAR-NK 細胞具有許多優(yōu)勢，但在目前的臨床應用中仍存在著一些挑戰(zhàn)。首先的障礙是轉(zhuǎn)染方式的選擇。目前的轉(zhuǎn)染方式主要分為病毒載體和非病毒載體。對于病毒載體而言，逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率很高[55]，但這種方法會引發(fā)隨機插入突變的發(fā)生，有一定概率的致瘤性；相對而言，慢病毒載體的插入溫和一些，引入突變的概率較低，但其轉(zhuǎn)染效率有待改善。為了克服病毒載體插入突變的問題，非病毒載體轉(zhuǎn)染方式受到了關注。但常用的電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染的CAR 結(jié)構(gòu)不會整合進入基因組，只能短暫表達，持續(xù)3 d 左右[21]。隨著基因編輯技術的進步，已開發(fā)出多種可以使外源基因穩(wěn)定表達的編輯技術，如睡美人轉(zhuǎn)座子、TALEN、CRISPR 等[56]，有望在今后將這些技術應用于CAR-NK 細胞的構(gòu)建。此外，NK 細胞的生命周期短暫，NK-92 細胞系在使用前需要輻照，這些特點避免了持續(xù)殺傷含有腫瘤相關抗原的正常細胞，但也影響了CAR-NK 細胞治療的有效性。

5 結(jié)語

我們正處于細胞治療快速發(fā)展的元年，人類終于看到了戰(zhàn)勝腫瘤的希望。但是，仍然有許多問題等待著我們。相對于CAR-T的巨大成功，NK 細胞在理論上存在的優(yōu)勢是否在臨床試驗中能夠得以驗證，成為另一種便捷有效的即用型細胞產(chǎn)品，補充甚至是替代CAR-T 呢？另外，CARNK 目前面臨的許多問題，如NK 細胞來源選擇、CAR 結(jié)構(gòu)的取舍、轉(zhuǎn)染方式的改善等，都需要得到解決。相信隨著理論知識的完善，臨床研究的進行和聯(lián)合治療的發(fā)展，CAR-NK 細胞的治療方法在今后必然會占據(jù)一方舞臺。