申玲玲，杜光

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030)

咽炎是臨床常見病、多發(fā)病，表現(xiàn)為咽部異物感、梗阻感、干咳少痰、干燥、 灼熱、發(fā)癢、微痛等癥狀。咽炎屬中醫(yī)學(xué)中的“喉痹”范疇，中醫(yī)認為凡喉痹之病，不外乎熱熾、陰傷兩方面。急性咽炎多由上焦風(fēng)熱所致；慢性咽炎多由肺腎陰虛所致。

加味玄麥甘桔浸膏(XMGJ)由玄參、射干、麥冬、桔梗、甘草和開口箭等6味中藥組成，具有清熱解毒、瀉火利咽等功效，常用于急慢性咽炎引起的咽喉腫痛等的治療。該處方中君藥為玄參和射干，有利咽功效，臣藥是開口箭，有清熱解毒功效；佐藥是甘草和麥冬，具有養(yǎng)陰生津功效。前期筆者[1-2]對XMGJ提取工藝及質(zhì)量控制做了相關(guān)研究，現(xiàn)對XMGJ治療咽炎的療效進行了初步藥理學(xué)實驗研究，包括抗炎、祛痰及體外抑菌實驗，并對急性咽炎模型大鼠的血常規(guī)指標(biāo)變化、腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素(IL)-1指標(biāo)的影響進行了實驗研究，進一步探討XMGJ治療咽炎可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器 721型紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)；電子分析天平(METTLER TOLEDO公司，感量：0.1 mg)；高壓滅菌鍋(SS-325，日本TOMY公司)。

1.2實驗藥物 XMGJ的制備：將上述6種藥材補足吸水量，加10倍量水浸泡1 h，煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至稠膏(1.15～1.20 g·mL-1，80 ℃)；阿司匹林(每片100 mg，拜耳制藥公司)；復(fù)方草珊瑚含片(每片44 mg，江中藥業(yè)股份有限公司)；二甲苯(化學(xué)純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號：121204)；氨水(化學(xué)純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，批號：121006)；TNF及IL-1試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所，批號：201228)。

1.3動物與菌株 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，清潔級，華中科技大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0009，SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，清潔級，華中科技大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2010-0009。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院提供。所有動物都按照嚴格的操作規(guī)范進行，所有實驗進行時間為08：00-17：00。

1.4方法

1.4.1急性毒性實驗 采用孫氏改良寇氏法測定半數(shù)致死量(LD50)[3-4]。昆明種小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組為10只。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)計劑量為9.71～40.45 g·kg-1，各劑量間公比為r=0.7；實驗前禁食不禁水12 h，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，記錄小鼠給藥后的毒性癥狀及死亡情況，并計算LD50。

1.4.2抗炎作用 ①二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹。昆種明小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。根據(jù)LD50值XMGJ給藥劑量設(shè)大、中、小劑量組，大劑量組為LD50的1/10即3.07 g·kg-1，中劑量為大劑量的一半即1.54 g·kg-1，小劑量為中劑量一半即0.77 g·kg-1，阿司匹林組(阿司匹林0.15 g·kg-1)，陰性對照組為0.9%氯化鈉溶液(NS)組(0.15 g·kg-1)，均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，將二甲苯0.02 mL涂于每只小鼠的右耳前后兩側(cè)，左耳作對照。4 h后將小鼠處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑6 mm打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用精密扭力天平稱質(zhì)量。每只小鼠右耳質(zhì)量減去左耳的質(zhì)量即為腫脹度[4-5]。將對照組和給藥組的腫脹程度進行統(tǒng)計學(xué)處理。

②棉球誘發(fā)肉芽腫。昆明種小鼠50只，雌雄各半，分組和給藥量劑量與“1.4.1”項相同，阿司匹林組(阿司匹林0.15 g·kg-1)，陰性對照組為NS組(0.15 g·kg-1)。將(10±1)mg的棉球用青霉素和鏈霉素混合液0.2 mL浸泡，烘干，高壓滅菌。用乙醚麻醉小鼠后，無菌條件在小鼠腹部作1 cm長的切口，用眼科鑷子將棉球從切口處植入皮下，隨即縫合皮膚。待小鼠手術(shù)麻醉醒后，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。第8天將小鼠處死，取出棉球肉芽腫，置于60 ℃烘箱內(nèi)干燥12 h，稱質(zhì)量，減去原棉球質(zhì)量即為肉芽腫凈質(zhì)量，計算肉芽腫質(zhì)量[4-5]。

1.4.3氣管段酚紅法祛痰 昆明種小鼠50只，雌雄各半，分組和給藥量劑量與“1.4.1”項相同，氯化銨組(氯化銨溶液0.15 g·kg-1)，陰性對照組為NS組(0.15 g·kg-1)，均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d。末次給藥前饑餓16 h，給藥30 min后，腹腔注射5%酚紅NS溶液0.5 mL。注射30 min后，處死小鼠，分離小鼠氣管，用5%NaHCO3溶液1 mL進行沖洗，反復(fù)3次，合并3次沖洗液放置一定時間，取透明紅色的上清液，用紫外分光光度計在波長546 nm處測定吸光度(A值)，以A值代表酚紅排泄量與NS組進行統(tǒng)計比較[4，6]。

1.4.4急性咽炎 構(gòu)建急性咽炎模型：用喉部噴霧器將25%氨水噴在大鼠的咽部，每天2次，上午下午各一次。每次噴3下(約0.5 mL)，連續(xù)噴3 d。第4天，將大鼠分組和給藥，劑量與“1.4.1”項相同。復(fù)方草珊瑚組(復(fù)方草珊瑚含片4.8 g·kg-1)，陰性對照組給同體積的NS，均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)4 d。第7天，取5組大鼠股靜脈血，測量血漿中血常規(guī)指標(biāo)，血清中TNF及IL-1的含量[4-5]。

1.4.5二倍稀釋法抑菌實驗 XMGJ原液(1.00 g·mL-1)以巴多德法滅菌冷藏備用。以常見上呼吸道致病菌金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌為受試菌，在5 mL帶塞滅菌試管中分別加入各菌種所需培養(yǎng)基2.0 mL，每種菌種各8管。按1～8編號，分別在第1管中加入XMGJ原液2 mL，混勻后取出2.0 mL放入第2管，采用二倍稀釋法，依次將藥液稀釋成1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64系列溶液，即含藥量分別為0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 5，0.015 6 g·mL-1。各管均加入濃度約為5×105CFU·mL-1的各病原指示菌菌液0.2 mL，同時分別設(shè)陰性對照管(含藥液不含菌液)，陽性對照管(含菌液不含藥物)。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌種生長情況。病原菌濃度計算方法：觀察平板上的菌落形成單位(CFU)。<5 CFU·mL-1的濃度為抑菌濃度，標(biāo)記“-”號，≥5 CFU·mL-1的濃度為無抑菌濃度，標(biāo)記“+”，產(chǎn)生抑菌作用的最小濃度表示該管藥量即是受試藥的最低抑菌濃度(MIC)[4-5]。

2 結(jié)果

2.1LD50當(dāng)XMGJ劑量達到13.84 g·kg-1時，小鼠開始出現(xiàn)死亡，死亡數(shù)是3，后面不同比例劑量(19.82，28.36和40.45 g·kg-1)對應(yīng)的死亡數(shù)分別是3，4，5。通過計算得到LD50為30.71g·kg-1，結(jié)果顯示XMGJ的毒性較低。

2.2對二甲苯引起的小鼠耳腫脹影響 XMGJ對二甲苯引起的耳腫脹結(jié)果見圖1。大劑量組(3.07 g·kg-1)和中劑量組(1.54 g·kg-1)顯著抑制了耳腫脹程度(P<0.01)。與陰性對照組比較，小劑量組(0.77 g·kg-1)對耳腫脹也有一定的抑制作用(P<0.05)。并且XMGJ對二甲苯所致小鼠右耳廓腫脹的抑制作用呈顯著劑量依賴性。

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.1Comparisonofearswellingamongfivegroupsofmice(n=10)

2.3對小鼠棉球肉芽腫形成的影響 XMGJ對由無菌棉球引起的肉芽腫實驗結(jié)果見圖2。大劑量組(3.07 g·kg-1)和阿司匹林組(阿司匹林0.15 g·kg-1)對肉芽腫的抑制作用相當(dāng)，中、小劑量組對小鼠棉球肉芽腫形成也有抑制作用，并呈一定劑量依賴性。

2.4祛痰實驗 XMGJ對小鼠酚酞祛痰實驗結(jié)果見表1 。XMGJ不同劑量組均可增強氣管酚紅的排出。XMGJ最小劑量0.77 g·kg-1明顯可以增加酚紅排泌(P<0.05)。

2.5抑菌實驗 XMGJ體外抑菌實驗結(jié)果見表2。XMGJ對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和肺炎鏈球菌均有不同程度抑制作用，MIC值分別為0.031 5，0.031 5，0.015 6 g·mL-1。

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

Fig.2Resultsofgranulomaformationinfivegroupsofmice(n=10)

表1 5組小鼠祛痰情況比較

Tab.1ExpectoranteffectofXMGJinfivegroupsofmice

n=10

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group,*1P<0.05，*2P<0.01

表2 XMGJ體外抑菌作用

“-”：有抑菌作用；“+”：無抑菌作用

“-”：with bacteriostasis；“+”：without bacteriostasis

2.6血常規(guī)指標(biāo)的變化 XMGJ對急性咽炎模型大鼠血常規(guī)的影響見表3。從表3可以看出，模型大鼠在XMGJ作用下，血漿中白細胞計數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞百分比含量與陰性對照組比較明顯下降。

表3 5組大鼠的血常規(guī)指標(biāo)比較

Tab.3Comparisonofbloodroutineexaminationamongfivegroupsofrats

組 別劑量/(g·kg-1)白細胞計數(shù)/(×109·L-1)中性粒細胞淋巴細胞%陰性對照組4.809.86±1.2324.62±5.5676.72±6.06復(fù)方草珊瑚組4.807.65±1.12?130.49±3.35?167.89±4.37?1XMGJ 小劑量組3.078.75±1.08 ?228.89±5.1771.02±4.37?2 中劑量組6.147.46±1.13?131.34±4.83?169.65±4.45?1 大劑量組9.216.32±1.12?133.43±4.27?165.14±3.52?1

與陰性對照組比較，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.7血清中TNF和IL-1的變化 XMGJ對急性咽炎模型大鼠血清中TNF及IL-1水平的影響見表4。從表4可以看出復(fù)方草珊瑚組血清TNF、IL-1水平明顯低于NS組(P<0.01)，XMGJ不同濃度組別的TNF，IL-1水平與NS組比較也較低(P<0.05，0.01)。

表4 5組大鼠血清中TNF及IL-1變化

Tab.4VariationoftheserumlevelofTNFandIL-1infivegroupsofrats

n=10

與陰性對照組比較，*1P<0.01 ，*2P<0.05

Compared with negative control group，*1P<0.01 ,*2P<0.05

3 討論

玄麥甘桔湯是治療咽喉腫痛的要藥。方中甘草、開口箭清熱解毒；射干、桔梗、玄參、麥冬利咽潤肺化痰。諸藥合用，共奏解毒化痰，利咽潤肺之功。本研究從抗炎、祛痰和抑菌等藥理模型入手初步探討XMGJ治療咽炎的作用機制。

炎癥是機體局部組織受到損傷后所呈現(xiàn)的一種防御反應(yīng)，根據(jù)持續(xù)時間不同分為急性炎癥和慢性炎癥兩種。急性炎癥以發(fā)紅、腫脹、疼痛等為主要癥候；慢性炎癥多以增生、局部病變?yōu)橹?，其中肉芽腫性炎癥最為常見。二甲苯所致耳腫脹急性炎癥模型和棉球所致肉芽腫慢性炎癥模型是經(jīng)典的炎癥模型。這兩種動物模型常用于抗炎藥物的篩選和評估。在二甲苯所致小鼠耳腫脹的血管滲透性急性炎癥特性模型中，不同濃度的XMGJ均能顯著減小二甲苯所致小鼠耳腫脹度，說明XMGJ有可能通過降低血管通透性，減少各種黏附分子和細胞因子從血管滲到周圍的組織，從而達到舒緩咽炎的癥狀。在小棉球引起的肉芽腫實驗中，不同組別的XMGJ明顯抑制肉芽腫的生長，結(jié)果表明XMGJ可能通過抑制組織增生起到抗慢性炎癥的作用。

咽炎病變主要在咽部黏膜層，除了伴有黏膜慢性充血，黏液腺肥大，黏膜及黏膜下層結(jié)締組織增生，還有黏液分泌增多的癥狀。祛痰實驗利用酚紅能部分從氣管排泌的特點，隨著氣管分泌量的增加，上呼吸道黏膜排出的酚紅也增多，用分光光度計測出酚紅的排泌量，從而可以得知藥物祛痰作用的強弱。祛痰實驗結(jié)果顯示XMGJ能使小鼠氣管段酚紅排泌量顯著增加，促進局部血液循環(huán)，增加腺體的分泌，顯示XMGJ有較好的清咽利喉的功效。此外，細菌感染也是咽炎的重要致病因素之一，體外實驗中XMGJ對呼吸道常見致病菌如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌均有一定的抑制作用。

目前研究還發(fā)現(xiàn)炎癥細胞因子[7-8]在咽炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。炎癥細胞因子一方面可以促進血液血管內(nèi)皮細胞白細胞粘附。另一方面可以使血管內(nèi)皮細胞、中性粒細胞和巨噬細胞活化，增加血管通透性和刺激堿性成纖維細胞增殖和淋巴細胞增殖和分化。其中，TNF和IL-1又被稱為前炎癥因子[9]，是啟動抗菌炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子。TNF主要由活化的單核巨噬細胞產(chǎn)生，通過刺激血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，讓其粘附于白細胞，刺激巨噬細胞等分泌趨化性因子，引起白細胞在炎癥部位的聚集。IL-1具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，并伴有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用[10]。它在炎癥中主要作用是刺激單核巨噬細胞核內(nèi)皮細胞分泌趨化因子，并促進其粘附；促進外周肌肉溶解；通過促進T細胞生長分化，使其數(shù)目增加并激活B細胞產(chǎn)生抗體，達到增強免疫和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。由此可以看出，IL-1分泌增多時，炎癥及免疫反應(yīng)都會增強，有可能引起發(fā)熱、體質(zhì)量減輕及肉芽組織增生等。這些前炎癥因子的活動有利于抑菌和排除細菌。在急性咽炎模型中，XMGJ通過急性炎癥模型大鼠降低白細胞數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞含量而起到一定程度的抗炎作用。同時XMGJ還可以降低動物血清中TNF 和IL-1水平，從而抑制TNF引起的氣道反應(yīng)，以及激活內(nèi)皮細胞黏附分子使中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等聚集，減少IL-1對血管內(nèi)皮細胞的直接損傷，減少免疫黏附，促進內(nèi)皮的修復(fù)。這可能是該浸膏發(fā)揮治療咽炎作用的初步藥理機制。但是XMGJ到底如何發(fā)揮其治療咽炎的功效，還需進一步研究。