吳龍 劉晨 蔣宏傳

[摘要] 目的 利用miRNA芯片研究乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌患者中差異表達的microRNAs及其相關(guān)性，為乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌的早期預測提供理論依據(jù)。 方法 選擇2000年1月～2014年12月于首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院就診的乳腺癌患者為研究對象，以乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者為實驗組，并以乳腺癌術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患者（良性對照組）和乳腺癌術(shù)后無婦科疾患者（單發(fā)乳腺癌對照組）為對照，采用miRNA芯片和qRT-PCR技術(shù)，篩選并分析各組間差異表達的miRNAs。 結(jié)果 miRNA芯片檢測得到系列差異表達的miRNAs，其中miR-1234差異表達最顯著，利用qRT-PCR對miR-1234表達量進行驗證的結(jié)果也顯示，實驗組中miR-1234表達水平顯著高于良性對照組和單發(fā)乳腺癌對照組（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌術(shù)后卵巢癌的早期預測的敏感性和特異性均為80%。 結(jié)論 miR-1234在乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌患者與乳腺癌術(shù)后未患卵巢癌患者中表達差異最為明顯，有望成為乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌早期預測的腫瘤標志物。

[關(guān)鍵詞] 乳腺-卵巢雙原發(fā)癌;miR-1234;腫瘤標志物;預防性切除

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the differential expression of microRNAs and their correlation in patients with ovarian cancer after breast cancer operation by miRNA microarray， and to provide early prediction of postoperative ovarian cancer. Methods The patients with ovarian cancer who were admitted to Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University from January 2000 to December 2014 were enrolled as research objects. The patients with ovarian cancer after breast cancer surgery were regarded as experimental group， patients with complication of benign gynecological tumors followed by breast cancer （benign control group） and patients with no any abnormal after breast cancer surgery （single breast cancer control group） were regarded as control. The miRNA microarray and qRT-PCR were used to detect the differentially expressed miRNA levels among the groups. Results A series of differentially expressed miRNAs were detected by miRNA microarray， among which miR-1234 was the most significantly differentially expressed， and the results of verification of miR-1234 expression by qRT-PCR also showed that the expression level of miR-1234 in the experimental group was significantly higher than that in the benign control group and the single breast cancer control group （P < 0.05）. The sensitivity and specificity of early prediction of ovarian cancer after breast cancer surgery by using miR-1234 were 80%. Conclusion miR-1234 is the most obvious difference between patients with ovarian cancer after breast cancer surgery and those without ovarian cancer after breast cancer surgery. It is expected to be a tumor marker for early prediction of ovarian cancer after breast cancer operation.

[Key words] Breast-ovarian double primary cancer; miR-1234; Tumor marker; Preventive resection

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤[1]，而卵巢癌是致死率最高的女性生殖道腫瘤[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者術(shù)后卵巢癌的患病率較普通人群明顯增高，對乳腺癌患者預防性切除子宮和附件可以避免再次罹患卵巢癌的發(fā)生[3-4]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于乳腺癌、卵巢癌和乳腺-卵巢雙原癌的研究大多集中在基因水平，研究較多的為BRCA1/2基因[5-6]、K-Ras基因[7]、RAD51C基因[8]等，但諸多乳腺癌卵巢癌相關(guān)基因，如BRCA1/2，為大型基因，突變位點眾多，且中國人群尚無被證實的熱點位點，檢測花費巨大[9]。另外，雖然基因檢測具有較好的預測性，即基因突變陽性時，對乳腺癌或卵巢癌的患病風險值預測較高，但其檢出率較低[10-12]。microRNA（miRNA）是一類由約22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過調(diào)控人體內(nèi)相關(guān)基因的表達，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預后[13-14]。miRNA在外周血中穩(wěn)定存在，檢出譜系廣、靈敏度高、核苷酸序列短、檢測成本較低，可作為理想的腫瘤標志物用于腫瘤的早期預測[15-17]。

目前乳腺癌患者術(shù)后并發(fā)卵巢癌的相關(guān)miRNA鮮見報道。本研究旨在尋找可應(yīng)用于臨床的腫瘤標志物，確定乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌的高危個體，為其預防性切除提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2000年1月～2014年12月于北京朝陽醫(yī)院乳腺外科病理確診并規(guī)范治療的乳腺癌患者為研究對象，根據(jù)其隨診情況進行分組。將乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者納入實驗組，實驗組患者經(jīng)高年資病理科醫(yī)師行病理診斷，排除轉(zhuǎn)移性腫瘤情況;按照匹配因素將相匹配的乳腺癌術(shù)后未并發(fā)婦科惡性腫瘤者納入對照組，將乳腺癌術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患（子宮內(nèi)膜息肉、子宮肌瘤等）者納入良性對照組，將乳腺癌術(shù)后無婦科疾患者納入單發(fā)乳腺癌對照組。匹配因素：年齡相近（±5歲），與實驗組手術(shù)時間相近（±5年）。

1.2 方法

1.2.1 miRNA芯片技術(shù)篩選目標miRNA? 首先設(shè)計并合成一段通用標簽，在5′端修飾熒光分子，再依據(jù)miRNA文庫中的miRNA序列設(shè)計相應(yīng)的探針，探針的5′端是polyA10，中間一段序列與miRNA互補，3′端的一段序列與通用標簽互補，探針的5′端進行氨基修飾。同時制備醛基化基片，將探針溶解于點樣緩沖液中，點樣制備寡核苷酸陣列。將提取好的總RNA與通用標簽一并溶解于雜交溶液中，與探針陣列雜交。漂洗除去多余的樣品及通用標簽，最后采用掃描儀對信號檢測并進行分析，判斷miRNA的表達譜。

1.2.2 血漿RNA提取與實時熒光定量PCR（qRT-PCR）? 按照TRIzol LS試劑盒（北京賽因百奧生物技術(shù)公司）說明提取血漿總RNA，并利用First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括總RNA 2 μL、人miRNA RT引物或U6 snRNA RE引物1.2 μL、200 U/μL的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、2×Buffer 10 μL，加DEPC水至總體積20 μL;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為26℃ 30 min，42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，85℃酶失活10 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃下保存?zhèn)溆?。利用Real-Time PCR Master Mix（蘇州吉瑪基因）進行PCR檢測，反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、定量PCR Master Mix 10 μL、2.5 U/μL的Taq DNA 聚合酶0.4 μL、20 μmol/L的mRNA正向引物0.8 μL、20 μmol/L的mRNA反向引物0.8 μL，加去離子水至總體積20 μL。所有操作按照廠家提供說明書進行，所用引物序列見表1。反應(yīng)條件為95℃預變性3 min，然后再95℃變性30 s，62℃退火延伸40 s，循環(huán)40次。每個反應(yīng)重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GenePix 6.0軟件、EXCEL軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對于miRNA表達譜結(jié)果分析，先對miRNA表達譜數(shù)據(jù)進行歸一化。均一化后的數(shù)據(jù)進行兩種分析，①臨床配對比較：組內(nèi)各樣本作為單獨個體，根據(jù)臨床因素進行組間嚴格配對，進行差異miRNA的篩選，利用配對t檢驗計算其P值。在5個配對中都差異表達[差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>1.5或FC<1/1.5、P < 0.1]的miRNA，作為顯著差異表達的miRNA。②組間比較：對各組內(nèi)同一個miRNA在5個樣本中的表達量求平均值，然后三組間再兩兩比較，進行差異miRNA的篩選，F(xiàn)C>1.5或<1/1.5、P < 0.1的miRNA，作為顯著差異表達的miRNA。

1.4 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，篩查階段組間比較FC采用配對t檢驗;臨床配對比較FC與組間比較FC的相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析;驗證階段對三組樣品行單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線評價miR-1234用于早期診斷的價值。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況分析

本研究共納入樣本量15例，術(shù)后病理結(jié)果示，乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌者（實驗組）5例，術(shù)后并發(fā)婦科良性疾患者（良性對照組）5例，乳腺癌術(shù)后無婦科疾患者（單發(fā)乳腺癌對照組）5例。三組患者年齡及乳腺癌發(fā)病年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表2。

2.2 miRNA差異表達譜

在臨床配對比較中，a：實驗組和良性對照組組間差異表達明顯的miRNA有25個;b：實驗組和單發(fā)乳腺癌對照組組間差異表達明顯的miRNA有5個;c：單發(fā)乳腺癌對照組和良性對照組組間差異表達明顯的miRNA有2個;a和b間共有的差異表達的miRNA有3個;a和c間共有的差異表達明顯的miRNA有2個。提示臨床配對中差異表達明顯的miRNA有25個。見圖1。

在組間比較中，a：實驗組和良性對照組組間差異表達明顯的miRNA有69個;b：實驗組和單發(fā)乳腺癌對照組組間差異表達明顯的miRNA有5個;c：單發(fā)乳腺癌對照組和良性對照組組間差異表達明顯的miRNA有27個;a和b間共有的差異表達明顯的miRNA有4個;a和c間共有的差異表達明顯的miRNA有12個;b和c間共有的差異表達明顯的miRNA有1個。綜上所述，組間比較中差異表達明顯的miRNA有57個。見圖2。

差異表達明顯的11個miRNA均上調(diào)表達，其P值均<0.1，其中hsa-miR-3196、hsa-miR-6089、hsa-miR-762、hsa-miR-4271、hsa-miR-2861的P值<0.05。臨床配對比較中FC為（16.93±16.74），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-6086、hsa-miR-4447、hsa-miR-4271、hsa-miR-4472，其FC分別為57.70、38.55、17.52、15.80、15.04倍。組間比較統(tǒng)計分析出的FC為（6.75±3.37），前5位miRNA是hsa-miR-1234、hsa-miR-658、hsa-miR-4447、hsa-miR-92a-2-5p、hsa-miR-4472，其差異表達倍數(shù)分別為14.90、8.14、7.56、7.49、7.38倍。見表3。

經(jīng)直線相關(guān)分析，臨床配對比較中FC與組間比較FC呈正相關(guān)（r = 0.823，P = 0.002），隨著臨床配對比較中FC的增加，組間比較FC增加。提示根據(jù)兩種分析方法計算出來的FC雖然不同，但差異趨勢一致。

2.3 qRT-PCR結(jié)果分析

2.3.1 miR-1234表達分析? 對質(zhì)量檢測合格后的qRT-PCR結(jié)果進行分析，實驗組的miR-1234相對表達量（4.34±2.12）顯著高于單發(fā)乳腺癌對照組（0.48±0.22）和良性對照組（0.33±0.23），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但良性對照組與單發(fā)乳腺癌對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.69）。見圖4。

2.3.2 miR-1234用于早期診斷的價值評價? 根據(jù)miR-1234在實驗組和對照組（包括良性對照組和單發(fā)乳腺癌對照組）中的表達量，繪制其ROC曲線，計算曲線下面積，找到最佳cutoff值，計算在此cutoff值下對應(yīng)的miRA-1234用于乳腺癌術(shù)后患者卵巢癌的早期診斷的靈敏度和特異度，miRNA-1234用于乳腺癌術(shù)后患者卵巢癌的早期診斷的敏感性和特異性均為80%。見圖5。

3 討論

本研究對miRNA芯片表達譜的分析，為組間比較和臨床配對比較兩者相結(jié)合的方法。既往研究多只應(yīng)用組間比較的方法，因為其選擇的實驗組和對照組并未進行配對，有的研究實驗組和對照組病例數(shù)量也不相匹配[13-14]。而本研究根據(jù)患者年齡和乳腺癌手術(shù)時間進行了配對比較，再結(jié)合組間比較，找出共有的差異表達的miRNAs，提高了差異表達miRNA篩選標準，其結(jié)果更有說服力。研究結(jié)果顯示，miRNA芯片檢測得到系列差異表達的miRNAs，其中miR-1234差異表達最顯著，利用qRT-PCR對miR-1234表達量進行驗證的結(jié)果也顯示，實驗組中miR-1234表達水平顯著高于良性對照組和單發(fā)乳腺癌對照組（P < 0.05），并且miR-1234用于乳腺癌術(shù)后卵巢癌的早期預測的敏感性和特異性均為80%。

miR-1234作為較新的miRNA，目前在乳腺癌和卵巢癌中研究較少。Kiss等[18]在對唾液腺來源的腺樣囊性癌和乳腺來源的腺樣囊性癌對比研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1234僅在乳腺來源的腺樣囊性癌中表達，預示著miR-1234可能作為區(qū)分唾液腺和乳腺來源的腺樣囊性癌的標志。另外，H?gfeldt等[19]在對彌漫性大B細胞淋巴瘤的發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)，miR-1234表達水平與信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的表達呈負相關(guān)，表明STAT3可能是miR-1234的潛在靶標。miR-1234可能參與彌漫性大B細胞淋巴瘤的發(fā)生，并與環(huán)境背景暴露有關(guān)。而既往相關(guān)研究均表明，STAT3在卵巢癌中持續(xù)性激活，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[20-22]。這些結(jié)果提示，miR-1234可能靶向作用于STAT3，從而參與乳腺癌術(shù)后卵巢癌的發(fā)生。

本研究通過利用miRNA芯片表達譜檢測技術(shù)和qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌術(shù)后罹患卵巢癌患者與乳腺癌術(shù)后未患卵巢癌患者中存在系列差異性表達miRNA，其中以miR-1234表達差異最為明顯，提示其可能在乳腺癌術(shù)后并發(fā)卵巢癌早期預測中具有重要作用。

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（收稿日期：2018-05-10? 本文編輯：張瑜杰）