紀 猛，張媛媛，汪瑞辰

江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南京 210009

隨著生活水平的提高，人們的生活習慣和飲食方式發(fā)生了很大的改變，尤其是“紅肉”飲食的大量攝入[1，2]，使得我國結腸癌的發(fā)病率逐年增加，嚴重影響了人們的生存周期和生活質量。結腸癌具有增殖速率快、能量代謝旺盛、易發(fā)生轉移和侵襲的特點[3，4]，因而對于開發(fā)能夠抑制結腸癌細胞增殖、生長和轉移的藥物顯得極為緊迫。經典的結腸癌治療藥物的研發(fā)從化合物的篩選到成藥需要數(shù)十年時間和數(shù)億元的經費投入，嚴重限制了結腸癌的有效治療，因而從臨床常用的經典藥物入手，“老藥新用”的研發(fā)方式為藥學專家所關注。雙硫侖（disulfiram）[5]是一種常用的廉價戒酒藥物，因其能夠不可逆地抑制胞質內和線粒體內的乙醛脫氫酶，使嗜酒者轉而對飲酒產生厭惡和恐懼心理，從而放棄酗酒而達到戒酒目的。同時毒理學研究表明，單獨使用雙硫侖對機體不產生毒性作用，更可貴的是，研究表明，雙硫侖具有潛在的抗腫瘤潛力[6，7]且具體機制不清。因而，本研究通過體內體外細胞和移植瘤實驗考察雙硫侖的抗結腸癌作用，并通過低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）和葡萄糖轉運蛋白 1（Glucose transporter 1，GLUT1）信號通路[8，9]對其潛在的抗腫瘤作用機制進行研究，以期為后續(xù)的實驗及臨床研究提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

雙硫侖 （批號S826357，Selleck公司）；順鉑（Cisplatin，批號 S117264，Selleck 公司）；MTS 試劑盒（Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit，Biovision公司）；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Matrigel基底膜基質（批號6235007，美國BD公司）；HIF-1α和GLUT1單克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠SP檢測試劑盒（索萊寶公司）；其余試劑為化學純，均購自國藥化學有限公司；純化水（自制）。

1.2 細胞株

人結腸癌SW480細胞株，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.3 動物

BALB/c裸小鼠18只，體重18～22 g，均為雄性，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，動物合格證編號：201810315，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。動物自由飲水飲食，光照/黑暗時間12 h/12 h，環(huán)境溫度22℃～24℃，相對濕度50%～70%。

1.4 實驗儀器

電子天平（型號BSA224S-CW，Sartorius科學儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號3110，美國Thermo公司）；多功能酶標儀（型號GM3500，美國Promega公司）；純水儀（型號TANKPE060，美國Millipore公司）。

2 方 法

2.1 雙硫侖對SW480細胞增殖的影響

采用MTS法對細胞增殖能力進行檢測。采用0.25%胰酶對SW480細胞進行消化后，每孔接種5×103個細胞于96孔板中（100μL）。細胞貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實驗共分7個組，每組6個平行孔。各組雙硫侖濃度分別為0、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1或順鉑濃度分別為 0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1。 藥物分別處理 24 h或48 h后每孔加入20 μL MTS，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2h后于酶標儀490nm波長處檢測其吸光度值。

2.2 雙硫侖對SW480細胞遷移的影響

采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。細胞消化后，每孔接種3×105個SW480細胞于6孔板中（2 mL）。細胞貼壁后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去上清液，無菌PBS清洗細胞兩次后，用白色的10 μL槍頭沿每孔的中線垂直劃痕。然后無菌PBS繼續(xù)清洗兩次，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實驗共分4組，分別為：對照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1、8 μmol·L-1。每組設置 3 個平行孔。24 h后分別于100倍顯微鏡下拍照。細胞遷移率（%）=（1-24 h劃痕寬度/0 h時間點劃痕寬度）×100%。

2.3 雙硫侖對SW480細胞侵襲的影響

采用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力。于Transwell小室上室的膜表面均勻鋪被含Matrigel（去生長因子）的 DMEM培養(yǎng)基稀釋液（1∶4，體積比），置培養(yǎng)箱中稍微受熱使其凝固。將5×103個SW480細胞接種在Transwell小室的上室，同時于上室加入100 μL含藥培養(yǎng)基。實驗共分4組，分別為：對照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5 μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1。每組設置 3 個平行孔。Transwell下室加入 600 μL含 20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥物處理結束后，用棉簽小心將上室中沒有遷移的細胞拭去，將上室底部的膜取下，并按下述操作處理：用4%多聚甲醛固定10 min→PBS洗滌→0.1%結晶紫染色30 min→PBS漂洗3次→置載玻片上→200×鏡下隨機選5個視野進行拍照計數(shù)后、計算每個視野的平均值。

2.4 雙硫侖對SW480荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

SW480細胞經大量培養(yǎng)后，胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)。采用DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調至2×107/mL，后加入等體積的Matrigel膠混合均勻，調整細胞終濃度為1×107/mL。于Balb/c裸鼠右下肢皮下接種細胞懸液，每只接種體積為0.2mL。觀察腫瘤體積，待瘤塊直徑達0.5～1.0cm時，將裸鼠隨機分為3組，每組6只，分別為模型組、雙硫侖20mg·L-1組、40mg·L-1組。 采用灌胃給予相應的雙硫侖或生理鹽水，給藥體積為0.4 mL/20 g體重，實驗共21 d。用游標卡尺每3天測量各組裸鼠瘤體積，實驗結束后，處死裸鼠，取出瘤組織，進行拍照并稱重，腫瘤組織以4%的多聚甲醛固定以進行后續(xù)免疫組化實驗。腫瘤體積計算方法：V=A×B2×0.5，其中A為腫瘤最長直徑，B為腫瘤最短直徑。

2.5 雙硫侖對SW480荷瘤裸鼠腫瘤組織中HIF-1α和GLUT1蛋白表達的影響

采用免疫組化法檢測腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1蛋白表達水平。將固定后的腫瘤組織進行常規(guī)石蠟包埋及切片，6μm厚度為宜，切片經脫蠟水化，先經過氧化物阻斷、非免疫性動物血清保護后，加入HIF-1α和GLUT1一抗（1∶200進行稀釋）孵育過夜，清洗封閉后，加入生物素標記的二抗孵育、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶等步驟，進行DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。晾干后顯微鏡400倍進行拍照。采用Image J軟件統(tǒng)計HIF-1α和GLUT1蛋白的光密度值，計算平均光密度。平均光密度值=累計光密度/面積。

2.6 統(tǒng)計方法

實驗結果采用Graph Pad Prism 5軟件進行作圖分析，數(shù)據采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Student-Newman-Keuls post hoc檢驗進行組間比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 雙硫侖對SW480結腸癌細胞增殖具有抑制作用

采用不同濃度的雙硫侖分別處理SW480結腸癌細胞24 h和48 h，MTS結果顯示，雙硫侖16、32、64 μmol·L-1濃度時可以抑制腫瘤細胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應關系，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。雙硫侖處理結腸癌細胞24 h和48h 的 IC50分別為 42.12μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1（見圖1）。同時，順鉑處理結腸癌細胞24h和48h的IC50分別為 16.62μmol·L-1和 15.20μmol·L-1。實驗表明，雙硫侖能夠明顯抑制SW480結腸癌細胞的增殖。

3.2 雙硫侖抑制SW480結腸癌細胞的遷移

選取了對細胞增殖無顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1、8μmol·L-1濃度和順鉑 2.5μmol·L-1處理細胞 24h，研究雙硫侖對SW480結腸癌細胞遷移能力的影響。結果顯示，雙硫侖處理細胞 24 h 后，4 μmol·L-1組和8 μmol·L-1組均能夠抑制 SW480結腸癌細胞的體外遷移，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。結果表明，雙硫侖能夠抑制SW480結腸癌細胞的遷移（見圖2）。

圖1 雙硫侖對結腸癌細胞SW480增殖的影響（x±s，n=6）

圖2 雙硫侖對SW480結腸癌腫瘤細胞遷移能力的影響（x±s，n=3）

3.3 雙硫侖抑制SW480結腸癌細胞的侵襲

選取了對細胞增殖無顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1和 8 μmol·L-1濃度，處理細胞 24 h，研究雙硫侖對SW480結腸癌細胞侵襲能力的影響。結果顯示，雙硫侖 4μmol·L-1組和 8μmol·L-1組均抑制 SW480結腸癌細胞的侵襲，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，表明雙硫侖能夠抑制SW480結腸癌細胞的侵襲（見圖 3）。

圖3 雙硫侖對SW480細胞侵襲的影響（x±s，n=3）

3.4 雙硫侖對裸鼠移植瘤的抑制作用

裸鼠皮下移植瘤實驗結果顯示，雙硫侖20 mg·kg-1組和40 mg·kg-1組均能減少SW480裸鼠皮下移植瘤的體積和瘤重，且與模型組相比具有顯著性差異（P<0.01）。結果表明，雙硫侖能夠抑制SW480裸鼠皮下移植瘤的體內生長（見圖4）。

3.5 雙硫侖對GLUT1、HIF-1α因子表達的影響

結腸癌細胞體內生長極為迅速，因此伴隨著HIF-1α高表達，同時HIF-1α能夠促進結腸癌組織GLUT1表達增加，以促進腫瘤糖攝取和能量代謝[9]，因此采用免疫組化檢測腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1表達水平。結果顯示，在裸鼠移植瘤組織中，雙硫侖 20 mg·kg-1和 40 mg·kg-1均能夠降低 HIF-1α和GLUT1的蛋白表達。實驗結果表明，雙硫侖可能通過下調HIF-1α和GLUT1蛋白的表達，起到抑制腫瘤生長的作用（見圖5）。

圖4 雙硫侖對SW480細胞裸鼠皮下移植瘤的體內生長的影響，n=6）

4 討 論

雙硫侖是一種臨床廣泛使用的戒酒藥物，鑒于其具有安全無毒且潛在的抗腫瘤作用，使得對于研究雙硫侖的抗結腸癌作用及揭示其作用機制、開發(fā)新的抗結腸癌化療藥物具有重要的意義。殷文靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用雙硫侖單用或者聯(lián)合順鉑共用，均具有促進宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用，表明雙硫侖具有潛在的抗癌價值。因此本研究對雙硫侖抗結腸癌的作用及機制進行初步探索，并采用順鉑作為陽性藥進行比較。

圖5 雙硫侖對SW480細胞裸鼠皮下移植瘤HIF-1α、GLUT1的影響（x±s，n=6）

本研究表明，單獨使用雙硫侖能夠明顯抑制體外SW480結腸癌細胞和體內移植瘤的增殖和生長，24 h 和 48 h 的 IC50分別為 42.12 μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1，同時雙硫侖能夠抑制SW480細胞體外遷移和侵襲能力，其抑制作用與順鉑相近。鑒于結腸癌具有增殖迅速、能量代謝旺盛等特點，因而選取了缺氧誘導因子HIF-1[11]和葡萄糖轉運體GLUT1[12]對雙硫侖抑制SW480細胞惡性生物學行為的機制進行探討。研究已表明，腫瘤細胞最主要的特征是失控性生長，急劇生長的腫瘤細胞對于氧和糖的需求極其旺盛，為了維持其自身生長和增殖，則會調控一系列分子生物學反應來維持對氧和糖的獲取。HIF-1是一種腫瘤組織細胞適應缺氧環(huán)境的關鍵調控因子，能在缺氧狀態(tài)下維持細胞氧的穩(wěn)態(tài)。同時，腫瘤細胞也能夠通過HIF-1促進下游的GLUT1蛋白表達，增加腫瘤細胞葡萄糖的攝入，維持其能量代謝水平，進而促進增殖、生長、遷移和侵襲。因而開展腫瘤細胞和組織中的HIF-1和GLUT1蛋白表達的研究，對于揭示雙硫侖抗腫瘤的作用顯得尤為重要。免疫組化結果表明，模型組結腸癌移植瘤組織中HIF-1和GLUT1蛋白水平相對較高，這與文獻報道一致[12]，而給予雙硫侖治療后移植瘤中的HIF-1和GLUT1蛋白水平明顯降低，表明雙硫侖可能通過抑制結腸癌細胞內HIF-1和GLUT1蛋白水平，調控細胞能量代謝，從而起到抗結腸癌的作用。

綜上所述，雙硫侖能夠抑制結腸癌細胞的增殖、生長、遷移和侵襲，并發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與抑制腫瘤細胞HIF-1和GLUT-1蛋白表達水平、調控能量代謝有關，這也提示下一步實驗將采用基因敲除等方式來研究雙硫侖抗結腸癌的作用機制。本研究表明，雙硫侖是一個具有潛在研究價值的抗腫瘤藥物，具有較好的研發(fā)前景。