王興吉 賈仁潔 王克芬 劉文龍

摘要以本公司菌種保藏室的產(chǎn)脂肪酶黑曲霉菌株AG007作為出發(fā)菌株，通過(guò)常溫常壓等離子體（ARTP）誘變篩選得到突變株A45-72，其產(chǎn)脂肪酶的活力較AG007提高了86%。再對(duì)A45-72進(jìn)行亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變，得到突變菌株GH-73，其搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)到2 350 U/mL，較出發(fā)菌株AG007提高了1.2倍，將GH-73傳到第10代，其產(chǎn)酶較穩(wěn)定。搖瓶中添加2.5%橄欖油作為誘導(dǎo)劑時(shí)，產(chǎn)酶能力達(dá)到2 875 U/mL。通過(guò)酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，其最適作用溫度為30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一種低溫脂肪酶。

關(guān)鍵詞常溫常壓等離子體;亞硝基胍;復(fù)合誘變;低溫脂肪酶

中圖分類號(hào)S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0001-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

脂肪酶（Lipase， EC3.1.1.3）是一類具有特殊酯鍵的水解酶[1]，它能夠催化長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯的水解，也能夠催化該反應(yīng)的逆反應(yīng)，除此之外，許多微生物分泌的脂肪酶還能夠催化酯交換反應(yīng)、酸解反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)和酯化反應(yīng)等[2-3]。

微生物脂肪酶是指能夠分解或合成高級(jí)脂肪酸及丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶。微生物脂肪酶種類較多，具有比動(dòng)物脂肪酶更廣泛的溫度和pH作用范圍，便于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，它是一種重要的工業(yè)用酶，主要應(yīng)用于食品風(fēng)味及香味的改進(jìn)、油脂的水解、低等油脂的改性、皮革絹紡的脫脂、添加于化妝品及洗滌劑中等。特別是在有機(jī)合成工業(yè)及油脂化工行業(yè)中，酶催化的反應(yīng)具有耗能低、條件溫和及成品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的應(yīng)用潛力。

目前，工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶主要是高溫和中溫脂肪酶，酶的最適作用溫度一般在40 ℃左右或者更高，并且在0 ℃左右基本喪失活性[4-6]。低溫酶在較低溫度條件下仍然具有比較高的酶活，熱穩(wěn)定性下降[7]，因而在食品、洗滌、環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用。另外，低溫脂肪酶還具有熱不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，這對(duì)于某些工業(yè)性的生物催化來(lái)說(shuō)是有益的，例如，在食品的加工過(guò)程中，能夠在溫度較低的條件下快速使酶失去活力，進(jìn)而避免在酶的熱處理失活過(guò)程中對(duì)食品造成營(yíng)養(yǎng)損失[8]。

低溫脂肪酶是指最適反應(yīng)溫度在30 ℃左右，并且在0 ℃附近仍然具有一定催化活力的脂肪酶[9]。現(xiàn)在低溫脂肪酶產(chǎn)生菌大多數(shù)來(lái)自南北兩極和大洋底部等長(zhǎng)期處于低溫的環(huán)境中[10]。盡管產(chǎn)脂肪酶的微生物容易發(fā)現(xiàn)，可是，尋找到適合工業(yè)生產(chǎn)的脂肪酶生產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件卻比較困難，而通過(guò)傳統(tǒng)的誘變篩選能很大程度上提高脂肪酶的產(chǎn)量，使許多脂肪酶實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。以本公司菌種室保藏的黑曲霉菌株AG007作為出發(fā)菌株，采用ARTP和亞硝基胍復(fù)合誘變的手段，獲得了一株遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)脂肪酶菌株，并且對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

1材料與方法

1.1材料試驗(yàn)菌株，黑曲霉AG007，本公司菌種室保藏。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基。葡萄糖1.500%、玉米漿2.000%、硫酸銨0500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1.500%、氯化鈣0050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

1.2.2富集培養(yǎng)基。葡萄糖1.500%、酪素水解物1.000%、橄欖油乳化液1.500%、硫酸銨0.500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1500%、氯化鈣0.050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

1.2.3平板初篩培養(yǎng)基。

牛肉膏0.300%、蔗糖1.000%、硫酸鎂0.030%、胰蛋白胨0.300%、磷酸二氫鉀0.100%、酵母膏0100%、橄欖油乳化液2.500%，0.100%去氧膽鈉。

1.2.4斜面培養(yǎng)基。

蔗糖3.000%、硝酸鈉0.200%、硫酸亞鐵0010%、硫酸鎂0.025%、磷酸氫二鉀0.100%、氯化鉀0050%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂1.300%。

1.2.5搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基。玉米淀粉6.000%、玉米粉1500%、豆餅粉2.000%、蔗糖0.800%、麩皮2.000%、玉米漿1.600%、磷酸氫二鉀0200%、硫酸鎂0.250%、硫酸銨0300%、硝酸鈉0.800%、氯化鈣0020%、橄欖油2.000%。

1.2.6Tris緩沖液（pH 7.0）。馬來(lái)酸2.500%、氫氧化鈉2000%、硫酸銨0.200%、硫酸鎂0.020%、二水氯化鈣0025%。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1孢子懸液的制備。取一只新鮮培養(yǎng)的斜面，加入20 mL生理鹽水，用無(wú)菌鐵鏟將其表面的孢子刮下，并將其轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上振蕩打散30 min，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，濾液于10 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體用適量的生理鹽水重懸，調(diào)整孢子濃度在106～107[11]。

1.3.2ARTP誘變。取10 μL制備好的孢子懸液均勻涂布于載片中央，用無(wú)菌鑷子將載片轉(zhuǎn)移至ARTP系統(tǒng)操作室旋轉(zhuǎn)臺(tái)上的對(duì)應(yīng)孔位上，將照射距離調(diào)整為2 mm，氣流量10SLM，功率100 W，然后設(shè)置不同的照射時(shí)間進(jìn)行誘變[12]。

1.3.3亞硝基胍誘變。

1.3.3.1亞硝基胍（NTG）溶液的配制。

在生物安全柜中稱取0.035 g亞硝基胍于15 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL Tris緩沖液，將離心管置于熱水中待亞硝基胍完全溶解，制成NTG母液。

1.3.3.2誘變方法。

在無(wú)菌三角瓶中分別按表1加入制備好的孢子懸液、NTG母液及Tris緩沖液（其中，0#為對(duì)照組，1#、2#和3#為試驗(yàn)組）。然后將三角瓶于30 ℃條件下振蕩反應(yīng)30 min，反應(yīng)完畢后將三角瓶里面的液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入45 mL Tris緩沖液重懸，10 000 r/min離心5 min后棄上清，再加入45 mL Tris緩沖液沖洗，反復(fù)沖洗3次，以除去殘留的NTG，最后加入5 mL Tris緩沖液和5 mL 50%甘油重懸菌體。

1.3.4脂肪酶活力的測(cè)定方法。

用聚乙烯醇橄欖油乳化液法測(cè)定[13]，一個(gè)酶活定義為在測(cè)定條件下，每分鐘釋放1 μmol脂肪酸所需要的酶量。

1.3.5篩選方法。

1.3.5.1初篩方法。將誘變后的菌懸液接種到添加酪素水解物的富集培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min條件下富集培養(yǎng)2 h。將富集培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)涂布平板，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，觀察各個(gè)菌落周圍油脂水解圈的大小及菌落形態(tài)，選取水解圈較大或菌落形態(tài)發(fā)生變化的菌株轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中。

1.3.5.2復(fù)篩方法。挑取斜面長(zhǎng)好的菌種接入種子培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)3 d。將長(zhǎng)好的種液按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶中，30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，將發(fā)酵液于10 000 r/min條件下離心5 min，取上清測(cè)定酶活。

2結(jié)果與分析

2.1ARTP誘變結(jié)果

2.1.1ARTP誘變時(shí)間的確定。氣流量10SLM，功率100 W，將經(jīng)ARTP處理不同時(shí)間的孢子懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布于篩選平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，計(jì)算不同照射時(shí)間的致死率及正突變率，選擇合適的誘變時(shí)間。

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸增加，當(dāng)誘變時(shí)間為40 s時(shí)，致死率達(dá)到99%以上。通過(guò)計(jì)算正突變率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘變時(shí)間為30 s時(shí)，致死率達(dá)到86.7%，而正突變率為25%，此時(shí)繼續(xù)增加誘變時(shí)間正突變率隨之降低，所以試驗(yàn)中將誘變時(shí)間選為30 s。

2.1.2ARTP誘變篩選結(jié)果。

經(jīng)過(guò)ARTP誘變，共篩選到10

株酶活提高較大的突變菌株。搖瓶復(fù)篩結(jié)果表明，這10株正突變菌株遺傳性穩(wěn)定，其酶活提高比例及產(chǎn)孢子結(jié)果如表3所示。試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該10株突變菌株產(chǎn)孢子的量比對(duì)照菌株都有不同程度地減少，其中突變菌株A45-72酶活提高了86%，產(chǎn)孢子量最少，所以將其選為下一步NTG復(fù)合誘變的出發(fā)菌株。

2.2 NTG誘變結(jié)果

2.2.1NTG誘變劑量的選擇。

在誘變時(shí)間為30 min的條件下，不同NTG濃度下的致死率如表4所示。試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著NTG濃度的提高，致死率逐漸增加。通過(guò)計(jì)算正突變率發(fā)現(xiàn)，隨著NTG濃度的增加，正突變率先上升后下降，當(dāng)NTG終濃度為25 μg/mL時(shí)正突變率最高，此時(shí)致死率為80.7%，繼續(xù)增加NTG濃度，正突變率會(huì)相應(yīng)的降低，所以試驗(yàn)中選擇NTG終濃度為25 μg/mL。

2.2.2NTG誘變篩選結(jié)果。通過(guò)NTG誘變篩選到一株酶活提高較大的突變株GH-73，該突變菌株的搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)到2 350 U/mL，相對(duì)于原始菌株酶活提高了1.2倍。該菌株的生長(zhǎng)速度比原始菌株要慢，不產(chǎn)孢子。

2.3突變菌株遺傳穩(wěn)定性研究

將突變菌株GH-73連續(xù)進(jìn)行10代培養(yǎng)，以測(cè)定其遺傳穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，該菌株10次傳代酶活均在2 200 U/mL以上，表明該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.4誘導(dǎo)劑對(duì)菌株GH-73產(chǎn)酶的影響

2.4.1油脂種類對(duì)菌株GH-73產(chǎn)酶的影響。某些微生物 只有在誘導(dǎo)物存在時(shí)才能產(chǎn)生脂肪酶[14]，采用以上搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加不同種類2%油脂作為誘導(dǎo)劑，采用上述發(fā)酵方法測(cè)定酶活，結(jié)果如表6所示。可以看出，誘導(dǎo)劑為橄欖油時(shí)，誘變菌株GH-73搖瓶發(fā)酵酶活最高，酶活為2356 U/mL，表明以橄欖油作為誘導(dǎo)劑時(shí)該菌株產(chǎn)脂肪酶活力最高。

2.4.2橄欖油的添加量對(duì)菌株GH-73產(chǎn)酶的影響。以橄欖油作為誘導(dǎo)劑，在上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同用量，采用上述發(fā)酵方法測(cè)定酶活，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯谝欢ǖ臐舛确秶鷥?nèi)，隨著橄欖油添加量的增加，酶活隨之增加，當(dāng)添加量為2.5%時(shí)，產(chǎn)酶最高，酶活為2 875 U/mL。此時(shí)，再繼續(xù)增加橄欖油的添加量，菌株產(chǎn)脂肪酶的活力降低。所以，發(fā)酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。該試驗(yàn)結(jié)果與Gupta 等[15]報(bào)道的結(jié)果相符，油脂濃度的添加量會(huì)影響菌株產(chǎn)脂肪酶的能力，隨著油脂濃度的升高，菌株產(chǎn)脂肪酶的活力相應(yīng)上升，但是當(dāng)油脂添加量過(guò)高時(shí)，又會(huì)抑制脂肪酶的生產(chǎn)。

Fig.1Effect of different volumes of olive oil on lipase production by strain GH73

2.5菌株GH-73酶學(xué)特性研究在0～50 ℃范圍內(nèi)測(cè)定同一酶液的脂肪酶活力，結(jié)果如圖2所示，該酶最適溫度為

30 ℃，并且在0 ℃左右具有一定的催化活性。在0～30 ℃隨

著溫度的升高酶活相應(yīng)上升，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，酶活迅速下降，表明該突變菌株產(chǎn)生的脂肪酶為低溫脂肪酶。

3結(jié)論

通過(guò)ARTP和NTG復(fù)合誘變，篩選出一株酶活提高1.2倍的高產(chǎn)菌株GH-73，該菌株不產(chǎn)孢子，生長(zhǎng)速度相對(duì)于對(duì)照菌株有所變慢，搖瓶酶活力達(dá)到2 350 U/mL，10次傳代后酶活力維持在2 300 U/mL左右，遺傳穩(wěn)定性好。

以橄欖油作為誘導(dǎo)劑時(shí)，該菌株產(chǎn)脂肪酶活力最高，并且在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著橄欖油添加量的增加，酶活增加，當(dāng)添加量為2.5%時(shí)產(chǎn)酶最高，酶活為2 875 U/mL。此時(shí)，再繼續(xù)增加橄欖油的添加量，菌株產(chǎn)脂肪酶的活力降低。所以，發(fā)酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。

對(duì)該菌株進(jìn)行酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，其最適作用溫度為30 ℃，且在0 ℃左右保留30%的活性，是一種低溫脂肪酶，因此，在食品、洗滌、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

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