李玉玲 李建橋 胡建忠 賀海波 鄒 坤 李 蓉 殷麗強 汪鋆植

(1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院&天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室, 湖北 宜昌 443002； 2.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心, 北京 100053)

小花清風(fēng)藤(Sabia.ParvifloraWall.ex Roxb)為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物，主要分布于貴州、云南、廣西等地[1-3]，其莖根入藥治療急性黃疸型肝炎，清熱利濕并治療風(fēng)濕勞傷[4-5]．本實驗用四氯化碳(CCl4)復(fù)制小鼠的肝損傷模型，觀察小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性損傷的保護(hù)作用，為今后進(jìn)一步研究其保肝護(hù)肝作用及可能的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

小花清風(fēng)藤莖和葉采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興義市冊亨縣，植物標(biāo)本現(xiàn)保存于該實驗室(標(biāo)本編號：201700227)．小花清風(fēng)藤莖、葉及莖葉自然混合物用水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取后，濃縮干燥后，其莖經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為20.0 g、11.23 g和20.0 g，1 g干膏相當(dāng)于生藥量分別為10、17.8和10 g生藥；其葉經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為36.02 g、45.64 g和12.00 g，1 g干膏相當(dāng)于生藥量分別為5.5、4.4和16.7 g生藥；其莖和葉混合物經(jīng)水、50%乙醇和95%乙醇超聲提取和濃縮，干膏重量分別為24.72 g、20.14 g和15.00 g，1 g干膏相當(dāng)于生藥量分別為8.1、9.9和13.3 g生藥．水飛薊素膠囊(德國馬博士大藥廠，批號：150214，規(guī)格：140 mg/顆)．

1.2 實驗動物

選擇野生型KM小鼠168只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，購于三峽大學(xué)實驗動物中心并飼養(yǎng)于SPF級動物室，許可證號：SCXK(鄂)2011-0012．

1.3 試劑

CCl4(分析純)：成都市科龍化工試劑廠；歐麗微蘭橄欖油：廣州市糧油工業(yè)有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)：南京建成生物工程研究所；蛋白定量檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純．

1.4 儀器

電子分析天平：中國上海梅特勒-托利多有限公司；臺式高速離心機(jī)：德國Eppendof公司；Tecan多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN集團(tuán)公司．脫水機(jī)：德國Leica公司；超薄切片機(jī)：奧地利萊卡公司；攤片烤片機(jī)：孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)：德國Leica公司．

1.5 實驗方法

1.5.1 CCl4橄欖油溶液的配置

用移液器分別取0.5 mL的CCl4加入橄欖油定容至50 mL，混合均勻，配置體積分?jǐn)?shù)為0.5%的CCl4橄欖油溶液，于通風(fēng)櫥操作，現(xiàn)配現(xiàn)用．

1.5.2 實驗分組及給藥

取昆明雄性小鼠共168只，隨機(jī)分為21組，每組8只，即正常組、CCl4模型組、水飛薊素組(200 mg/kg)、水提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組、50%乙醇提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組、95%乙醇提取組(莖、葉、莖葉自然混合)低、高劑量組．正常組灌胃給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，其余組均按20 mL/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d．于末次給藥后2 h，除正常組實驗小鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組均按10 mL/kg的劑量腹腔注射0.5%的CCl4橄欖油溶液．實驗期間自由飲水和進(jìn)食．

1.5.3 實驗小鼠行為及體征觀察

每天觀察實驗小鼠的活動、進(jìn)食、精神狀態(tài)、毛發(fā)、排泄物及死亡情況．

1.5.4 肝臟質(zhì)量的稱量和指數(shù)的計算

實驗小鼠眼眶取血完畢后，取肝臟進(jìn)行稱量，計算其質(zhì)量指數(shù)．

1.5.5 肝組織中ALT和AST活性測定

取肝臟組織用生理鹽水進(jìn)行組織勻漿后，用離心機(jī)離心15 min后，收集上清液，用多功能酶標(biāo)儀檢測肝組織中ALT和AST含量．具體方法按照試劑盒中說明書進(jìn)行．

1.5.6 肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測定

取肝臟勻漿上清液測肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量．具體方法按照試劑盒中說明書進(jìn)行．

1.5.7 肝組織病理形態(tài)學(xué)分析

取血完畢后，取小鼠肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，不同乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟進(jìn)行切片包埋，經(jīng)HE染色后，在光鏡下觀察結(jié)肝組織病理學(xué)變化．

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

1)小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠行為和體征的影響如下：

在CCl4致急性肝損傷的小鼠模型制作過程中，正常組小鼠皮毛緊密、有光澤，活潑，飲食及二便均正常；模型小鼠給予CCl4后出現(xiàn)被毛松散，懶動；小花清風(fēng)藤的莖、葉及莖葉自然混合物用水(莖水提物：SJ，葉水提物：SY，莖葉自然混合物水提物：SJY)、50%乙醇(莖50%乙醇提物：50%AJ，葉50%乙醇提物：50%AY，莖葉自然混合物50%乙醇提物：50%AJY)和95%乙醇(莖95%乙醇提物：95%AJ，葉95%乙醇提物：95%AY，莖葉自然混合物95%乙醇提物：95%AJY)提取物治療后，均有不同程度的改善．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY作用效果最好，95%AJY和50%AY效果次之．

2)小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響，見表1～3．

表1 水提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表2 50%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表3 95%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝質(zhì)量及質(zhì)量指數(shù)的影響

續(xù)表3

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表1～3可見，模型組小鼠的肝質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)明顯增加，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用小花清風(fēng)藤的莖、葉及莖葉自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，均有不同程度的降低．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、SJ和50%AJY作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

3)小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響，見表4～6．

表4 水提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表5 50%乙醇提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

表6 95%乙醇提取物對ALT、AST活性的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表4～6可見，模型組小鼠肝組織中ALT和AST活性顯著升高，以ALT升高較為明顯，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用小花清風(fēng)藤的莖、葉及莖葉自然混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最為明顯．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

4)小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織形態(tài)學(xué)的影響，如圖1～3所示．

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；D：SJ-L組；E：SJ-H組；F：SY-L組；G：SY-H組；H：SJY-L組；I：SJY-H組圖1 水提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學(xué)的影響

鏡下組織學(xué)觀察：正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)較為清楚，以中央靜脈為中心的肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝索排列規(guī)則有序，肝竇、匯管區(qū)成纖維細(xì)胞少．模型組小鼠肝組織可見脂肪變性，肝細(xì)胞腫

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；J：50%AJ-L組；K：50%AJ-H組；L：50%AY-L組；M：50%AY-H組；N：50%AJY-L組；O：50%AJY-H組圖2 50%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學(xué)的影響

A：正常組；B：模型組；C：水飛薊素組；P：95%AJ-L組；Q：95%AJ-H組；R：95%AY-L組；S：95%A Y-H組；T：95%AJY-L組；U：95%AJY-H組圖3 95%乙醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織病理學(xué)的影響

脹，間界限不清，呈現(xiàn)彌漫性小泡性脂變，胞質(zhì)中可見脂肪滴，細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)邊緣；肝小葉和匯管區(qū)可見炎癥細(xì)胞浸潤，肝竇、匯管區(qū)成纖維細(xì)胞增多，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；SY、50%AY和95%AY組肝內(nèi)雖可見片狀壞死或點狀壞死，但壞死程度和模型組相比無明顯差異(P>0.05)；50%AJ和95%AJ組肝內(nèi)偶見點狀壞死，壞死程度比模型組明顯減輕，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)；SJY、SY、50%AJY和95%AJY組肝細(xì)胞損傷和壞死程度顯著減輕，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)．

5)小花清風(fēng)藤莖葉藥用部位不同溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響，見表7．

表7 不同溶劑提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

與正常組比較，#P<0.05,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表7可見，模型組中SOD和GSH-Px活性明顯下降，MDA含量明顯升高，以SOD上升較為明顯，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用SJY、50%AJY和95%AJY治療后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA含量有不同程度降低，尤其是對MDA的改善效果最為明顯．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY的作用效果最為顯著，與模型組比較，差異有顯著和非常顯著性意義(P<0.05或P<0.01)．

3 討 論

CCl4等多種毒性物質(zhì)所引起的肝損傷以及病毒性肝炎的病理學(xué)機(jī)制與自由基的生成造成脂質(zhì)過氧化有關(guān)，故自由基清除劑有可能拮抗其肝毒性[6-7]．

已有研究表明，小花清風(fēng)藤對病毒性肝炎和急性肝損傷具有較好的療效，但是何種有效組分(成分)發(fā)揮療效，目前尚未完全弄清楚．在實驗中發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)CCl4損傷后，小鼠肝組織中ALT和AST均明顯升高；用小花清風(fēng)藤的莖、葉及莖葉混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，ALT和AST活性均有不同程度的降低，尤其是ALT改善效果最為明顯．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY、95%AJY和50%AJY作用效果最為顯著．實驗提示小花清風(fēng)藤具有一定的保護(hù)肝臟活性并且莖葉混合物部位作用較強，呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系．病理形態(tài)學(xué)觀察到模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷較嚴(yán)重，小花清風(fēng)藤莖葉水提取部位組對小鼠的肝損傷有明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整，氣球樣肝細(xì)胞難以見到，炎性細(xì)胞浸潤很少，顯示其有明顯的抗肝損傷作用．

ROS可被生物體內(nèi)SOD清除，從而減輕其對細(xì)胞造成的損傷．谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的非蛋白巰基，在體內(nèi)主要以GSH和GSSG存在，肝臟是其體內(nèi)合成的主要場所[8-11]．研究結(jié)果顯示，經(jīng)CCl4處理后，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性降低顯著，而MDA含量明顯升高；用小花清風(fēng)藤的莖葉混合物的水、50%乙醇和95%乙醇提取物治療后，SOD和GSH-Px活性均有不同程度的升高，MDA有不同程度降低，尤其是MDA的改善效果最為明顯．在小花清風(fēng)藤不同藥用部位及溶劑提取物中，以SJY的作用效果最為顯著．上述實驗結(jié)果與肝組織形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致．

綜上所述，小花清風(fēng)藤對CCl4致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，可減輕CCl4對肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷，降低肝組織中ALT和AST活性，升高肝組織中SOD和GSH-Px含量，降低肝組織中MDA含量，從而減輕CCl4對肝組織氧化應(yīng)激損傷，改善肝臟病理組織學(xué)形態(tài)，保護(hù)肝細(xì)胞從而恢復(fù)肝功能，并驗證其作用機(jī)制與其抗氧化作用有關(guān)．在小花清風(fēng)藤水提取組低、高劑量組、50%乙醇提取組低、高劑量組、95%乙醇提取組中，以SJY作用效果比較好，依次是50%AJY、95%AJY、SJ、50%AJ、95%AJ、SY、50%AY、95%AY，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系．