歐陽(yáng)菠，張 明，蔡永華，楊 營(yíng)，鄭程莉，程建國(guó)，周 明，李 彪， 赟鐘 ，徐豐奕，楊建東*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130；2.四川養(yǎng)麝研究所，成都 610016）

關(guān)鍵字：林麝；FSHR 基因；克隆；進(jìn)化分析

林麝（Moschus moschiferus）是國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，被列入中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)和瀕危動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約（CITES），在歷史上廣泛分布于中國(guó)的13 個(gè)省[1-2]，其中以四川、陜西數(shù)量最多[3]。然而，由于人類(lèi)活動(dòng)干擾，野生林麝數(shù)量從20世紀(jì)60年代末的一百多萬(wàn)頭銳減至20世紀(jì)90年代末的20 萬(wàn)頭左右[4]。為了拯救野外瀕危的種群，我國(guó)自從1958年就著手開(kāi)展人工養(yǎng)麝繁育研究。目前，人工飼養(yǎng)林麝和活體取香已經(jīng)取得了一定的成果，林麝的圈養(yǎng)種群規(guī)模有所擴(kuò)大，進(jìn)而對(duì)野外種群的壓力起到了一定的緩解作用。盡管人工繁育林麝取得了一定成果，但是圈養(yǎng)種群數(shù)量還是有限，而且有關(guān)林麝生殖的遺傳機(jī)制也不清楚。

促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）是調(diào)控動(dòng)物繁殖活動(dòng)的重要激素之一，是垂體分泌的一種糖蛋白激素，對(duì)動(dòng)物卵巢的生長(zhǎng)，發(fā)育等起著必不可少的作用[5]。FSH 的生物學(xué)信息必須通過(guò)位于卵巢卵泡靶細(xì)胞上的促卵泡激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）的介導(dǎo)，才能發(fā)揮其生物學(xué)功能[6]。 FSHR 基因的研究始于Sprengel 等在老鼠中發(fā)現(xiàn)FSHR 基因[7]，隨后該基因被證明能影響FSH 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且不同的FSHR 基因的多態(tài)性對(duì)于卵母細(xì)胞形成有顯著性影響[8]。 目前，在豬、牛、羊等家畜上已經(jīng)開(kāi)展FSHR 基因的相關(guān)研究工作，發(fā)現(xiàn)基因的第1 和第10 個(gè)外顯子可以作為繁殖性能和生產(chǎn)性能的標(biāo)記基因[9-13]。因此，F(xiàn)SHR 基因可以作為常規(guī)選育中輔助選擇的分子標(biāo)記，幫助加快育種進(jìn)程和更加具有目的性的對(duì)育種動(dòng)物進(jìn)行選育，減少選育優(yōu)良品種所需要的時(shí)間。

然而，迄今為止還未見(jiàn)有關(guān)林麝FSHR 基因的研究報(bào)道。 因此，本研究擬采用PCR 克隆測(cè)序的方法克隆林麝FSHR 基因，并運(yùn)用進(jìn)化分析的方法對(duì)其核苷酸序列結(jié)構(gòu)及其所編碼蛋白序列進(jìn)行分析，從基因水平上比較不同物種FSHR 基因的差異，為進(jìn)一步開(kāi)展FSHR 基因的表達(dá)調(diào)控、 基因多態(tài)性等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品采自四川養(yǎng)麝研究所人工繁殖的雌性林麝耳緣組織80 只，樣本保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室。

1.2 林麝組織基因組DNA 提取

用滅菌的手術(shù)剪剪取40 mg 保存于無(wú)水乙醇中的林麝耳緣組織樣品，放入1.5 mL 的Eppendorf（EP）管中，盡量剪碎；然后加入800 μL 去離子水（TIANGEN）浸泡10 min，混合搖勻，離心，棄去上清液，重復(fù)3 次；加入1×TE 溶液置換2 次，以確保充分去除酒精。經(jīng)處理后的林麝耳緣組織DNA 提取按照常規(guī)酚/氯仿法提取，提取的DNA 用ND-2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop，美國(guó)） 檢測(cè)其濃度。 -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)主要根據(jù)NCBI 上已公布FSHR 基因的臨近物種家牛（Bos taurus，AC_000168.1）和綿羊（Ovis aries，NC_019460.1）的基因序列，利用primer5.0在基因外顯子上下游的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物（表1），送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增及克隆測(cè)序

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)均在PE9700 型PCR 儀上完成。PCR 擴(kuò)增體系：DNA 模板1.5 μL，正反向引物各0.5 μL，PCR 預(yù)混液（成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司）22.5 μL，共25 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃。 變性30 s，復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 kb/min，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸8 min，4 ℃保存。

所得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)l.2%瓊脂糖凝膠電泳，使用Axygen 凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，采用pMDl8-T Vector 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，挑取陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切、PCR 鑒定后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 序列分析

序列校對(duì)使用Chmmosoma 1.62、DNAStar 7.2等軟件。同源相似性及蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)采用DNAMAN軟件[15]。疏水性分析使用ExpASy protenomics 服務(wù)器（https：//www.expasy.org/proteomics）中的protscale 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。 采用在線分析軟件HNN secondary structure predictionmethod（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html）

對(duì)林麝FSHR 基因蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。 采用MEGA5.0 軟件分析序列特征，計(jì)算序列間堿基對(duì)的差異信息[15]。 從GenBank 中下載了12 種動(dòng)物的FSHR基因序列（表2），用MEGA5.0 構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，采用的方法為NJ（neighbor-joining）及ME（minimum evolution）法，分支置信度采用自展（Bootstrap）檢驗(yàn)法進(jìn)行評(píng)價(jià)，自展檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1 000 次。

表1 林麝FSHR 各段外顯子引物序列Table 1 Exon primer sequences of FSHR fragments in forest musk deer

表2 GenBank 上獲取的FSHR 序列信息Table 2 FSHR sequence information obtained on GenBank

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果和序列特征

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往成都擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)校對(duì)，拼接，除去質(zhì)粒載體及引物序列，得到林麝FSHR 基因序列（登錄號(hào)為：MG787948）。序列分析顯示林麝FSHR 含有10 個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為2 088 bp，CDS 區(qū)序列長(zhǎng)度為1 971 bp，共編碼656 個(gè)氨基酸殘基（圖1）。A、T、G、C 的含量分別為25.57%、26.18%、20.70%和27.55%，A+T 含量為51.75%，G+C 含量為48.25%。

2.2 蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)林麝FSHR 蛋白預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量為73.78 kDa，理論等電點(diǎn)（PI）為6.77，在pH=7.0 的條件下的帶電荷量-2.27。 疏水性分析結(jié)果表明，林麝FSHR 蛋白的氨基酸殘基大部分為疏水蛋白殘基，其總平均疏水性系數(shù)（GRAVY）為0.203。

2.3 FSHR 基因同源性分析

FSHR 基因同源性分析顯示，林麝FSHR 基因編碼區(qū)序列與家牛、印度水牛、藏羚羊、綿羊、白尾鹿、家馬、雙峰駱駝、單峰駱駝、野豬、家犬、家貓、原雞的同源性分別為96.1%、95.9%、95.4%、95.3%、95.0%、92.3%、91.3%、91.2%、90.2%、91.2%、90.8%、71.2%（表3）。

2.4 FSHR 基因進(jìn)化分析

根據(jù)所得核苷酸序列，通過(guò)NJ（neighbor-joining）法與ME（minimum evolution）法（圖2）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果顯示根據(jù)NJ 樹(shù)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，林麝FSHR 基因與家牛、羊、鹿的親緣關(guān)系最近，與原雞親緣最遠(yuǎn)。此外，通過(guò)使用ME 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與NJ 法所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)一致。

3 討論與結(jié)論

圖1 林麝FSHR 基因CDS 序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列Figrue 1 The CDS sequence of the FSHR gene in the musk deer and its deduced amino acid sequence

圖2 林麝與其他12 個(gè)物種FSHR 基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree constructed from the musk deer and other 12 species of FSHR genes

繁殖相關(guān)功能基因選擇在動(dòng)物育種當(dāng)中起到了極其重要的作用，可以為動(dòng)物選育提供重要信息[16-17]。FSHR 基因的結(jié)構(gòu)和功能可以顯著的影響FSH 的活性從而對(duì)動(dòng)物的繁殖性能形成顯著地影響[18]。 我們的研究表明林麝的FSHR 基因的開(kāi)放閱讀框由10個(gè)外顯子組成。序列分析表明林麝與牛、綿羊等哺乳動(dòng)物的FSHR 基因結(jié)構(gòu)基本一致[19-20]。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示林麝先與牛科動(dòng)物合為一支，后與綿羊等相聚合，其結(jié)果與前人研究一致[21-22]。整個(gè)基因樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也與這12 個(gè)物種的生物學(xué)分類(lèi)上的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一致的，這些結(jié)果表明FSHR 基因或許可作為系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究的有效候選基因之一。 通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，林麝的FSHR 基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與黃牛，山羊等哺乳動(dòng)物的FSHR 基因生物信息極為相似[21，23-24]，說(shuō)明FSHR 基因及其編碼產(chǎn)物具有較強(qiáng)的保守性。

目前，在豬、牛、羊等家畜上已經(jīng)開(kāi)展FSHR 基因的相關(guān)研究工作，發(fā)現(xiàn)山羊的FSHR 基因的5’UTR 區(qū)多態(tài)性與其的產(chǎn)仔數(shù)有極顯著的關(guān)聯(lián)[10]，小梅山豬FSHR 基因的第1 外顯子的多態(tài)性與其產(chǎn)仔數(shù)具有相關(guān)性[9]，牛的FSHR 基因的第10 個(gè)外顯子與牛的雙胎性狀具有相關(guān)性[25]，但是不同物種上FSHR 對(duì)其繁殖性能的影響并不是在同一SNP 位點(diǎn)，正因?yàn)槿绱?，F(xiàn)SHR 基因被很多學(xué)者當(dāng)成是影響畜禽繁殖性能的一個(gè)重要候選基因展開(kāi)相關(guān)研究，有關(guān)林麝繁殖候選功能基因的研究很少，僅王勤等人報(bào)道過(guò)林麝促卵泡激素和促黃體激素基因的克隆及其序列分析的研究[26]。 本研究通過(guò)林麝FSHR 基因的克隆和分析，獲得了林麝FSHR 基因序列并預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)氨基酸的部分理化性質(zhì)及特性，為進(jìn)一步從分子水平上揭示FSHR 基因在林麝上的作用機(jī)制及其影響林麝麝香產(chǎn)量及繁殖性能的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，擴(kuò)展了林麝研究的領(lǐng)域，為以后在分子水平上進(jìn)行林麝選種，提高麝香產(chǎn)量及進(jìn)一步開(kāi)展林麝相關(guān)功能基因的表達(dá)機(jī)制的研究提供了一定的參考數(shù)據(jù)。