尚書英,王建林,邵寶平

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國甘肅蘭州730000)

人類可能因治療、診斷、職業(yè)和意外事故而暴露在輻射中。輻射會對活細胞和組織造成損傷,這種損傷程度取決于輻射劑量、輻射時間、輻射后的時間間隔以及各個系統(tǒng)對輻射的敏感性等因素。由于輻射被認為是最重要的生物效應(yīng),因此該領(lǐng)域的研究主要集中于輻射對DNA的影響[1]。研究表明輻射對人體的損傷主要表現(xiàn)在兩方面,一是直接作用:輻射釋放的能量直接作用于生物大分子,使DNA受損斷裂為單鏈或雙鏈;二是間接作用:輻射引起原子和分子的電離和激發(fā),導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生,破壞生物大分子,從而活化細胞內(nèi)的信號分子或激活細胞信號通路,最終導(dǎo)致細胞生物學(xué)行為改變[2]。有研究發(fā)現(xiàn)輻射會引起大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能受損,其損傷機制可能是突觸結(jié)構(gòu)受損[3]。對神經(jīng)元突觸的可塑性研究發(fā)現(xiàn),輻射可引起腦功能和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使突觸結(jié)構(gòu)受損、神經(jīng)元變性、神經(jīng)遞質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂[4]。輻射會致使DNA損傷積累以及DNA修復(fù)效率降低,最終出現(xiàn)細胞衰老或凋亡[5]。近年來,有關(guān)輻射引起細胞衰老的機制研究少有報道,但有研究發(fā)現(xiàn)暴露在電離輻射中容易引起阿爾茨海默病等相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[6]。因此,研究輻射誘導(dǎo)細胞衰老的機制可為相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的診療提供一定的理論指導(dǎo)。

輻射會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),從而對DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷[7],引起代謝和功能的改變,最終導(dǎo)致細胞衰老或凋亡。在生物大分子中,DNA被認為是輻射誘導(dǎo)細胞損傷最關(guān)鍵的分子靶點。輻射致使DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs),DSBs有效地觸發(fā)一系列細胞反應(yīng),即DNA損傷反應(yīng),為了確?？焖贆z測和修復(fù)DSBs,機體會啟動衰老或凋亡程序清除受損的DNA。輻射誘導(dǎo)細胞衰老伴隨著一系列特征,其中包括β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)陽性表達量增加、活性氧含量增加、細胞周期相關(guān)蛋白(RB、p53、p21等)和一些表型分泌因子(IL-8、IL-12 等)表達量的增加(圖 1)。其涉及的衰老機制復(fù)雜,關(guān)聯(lián)許多信號通路。但無論通過哪條通路激活,誘導(dǎo)細胞衰老的信號最終都由p53-p21通路和p16-RB通路執(zhí)行。此外,最新研究報道,miRNAs也參與細胞衰老的復(fù)雜調(diào)控。

1 p53-p21信號通路

輻射通過線粒體或細胞膜上的NADPH氧化酶(NADPH oxidases)增加細胞內(nèi)ROS的水平,進而通過ATM/CHK2-p53-p21通路誘導(dǎo)細胞衰老[8]。DSBs由變性共濟失調(diào)(ataxia telangiectasia mutated,ATM)識別,其依賴于DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)功能來調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化應(yīng)激,被認為是細胞衰老的驅(qū)動因素[9～10]。DDR包括激活傳感器激酶如ATM和ATR,形成DNA損傷位點,如組蛋白變異體H2A.X(γH2A.X)、p53結(jié)合蛋白(53BP1)和其他的DNA損傷灶,激活細胞周期檢查點如p53蛋白。p53對細胞周期G1監(jiān)測點的調(diào)控主要由p21介導(dǎo),細胞衰老與細胞周期阻滯密切相關(guān)。有研究表明,在p21缺失的人微血管內(nèi)皮細胞中可以阻止由RAS誘導(dǎo)的細胞衰老[11]。而活化p21可抑制周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent protein kinase 2,CDK2)與周期蛋白E(cyclin E)復(fù)合物的結(jié)合,進一步抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)的磷酸化。細胞周期由G1期向S期的轉(zhuǎn)化依賴于RB的超磷酸化,而RB的低磷酸化會抑制性地結(jié)合E2F轉(zhuǎn)錄因子,最終導(dǎo)致細胞周期阻滯[12～13]。有人在研究輻射誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老時發(fā)現(xiàn),用ATM抑制劑處理細胞,p53和MDM2的表達受到抑制,而且該抑制劑對p21的表達也有一定的抑制作用;當(dāng)用抗氧化劑處理輻射后的細胞時發(fā)現(xiàn)衰老細胞明顯減少[14]。該結(jié)果表明輻射誘導(dǎo)的細胞衰老主要是由于ROS的產(chǎn)生進一步激活了p53-p21信號通路。

2 p16-RB信號通路

圖1 細胞衰老的標(biāo)記物特征Fig.1 The biomarkers of senescence

輻射會導(dǎo)致細胞內(nèi)p16表達上升[15],進而調(diào)節(jié)pRB-E2F通路。目前發(fā)現(xiàn)p16基因主要通過兩條途徑起調(diào)控作用:一條是表達p16蛋白,這條途徑主要通過抑制細胞增殖進程的p16-cyclinDCDK4/CDK6-RB通路發(fā)揮作用;另一條是p16基因的可變讀框(alterative reading frame,ARF),其轉(zhuǎn)錄為p14ARF蛋白(ARF在鼠細胞中為p19ARF),通過激活p53-p21通路使細胞停滯在G1期和G2期[16]。p16又被稱為周期蛋白依賴性激酶抑制因子1,是CDK4和CDK6等周期蛋白依賴性激酶的抑制劑。p16被激活會導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細胞瘤的磷酸化(pRB)失活,處于低磷酸化形式的RB與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合,進而控制細胞的周期進程[17～18]。細胞周期阻滯通過RB家族(pRB、p107和p130)和細胞核中的E2F結(jié)合而形成。此外,研究表明p16-RB通路與促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activatedprotein kinase,MAPK)協(xié)同誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,進而激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC),而后者又可反過來促進ROS的產(chǎn)生,這導(dǎo)致ROS與PKC之間形成正反饋環(huán),進一步使細胞周期阻滯。在MAPK信號通路中,p38對p16的調(diào)節(jié)是由HMG轉(zhuǎn)錄因子HBP1(HMG-box transcription factor 1)介導(dǎo)的[19]。HBP1是一個細胞調(diào)控因子,研究表明HBP1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與細胞周期調(diào)控和腫瘤抑制[20]。p38信號通路被激活后會引起下游HBP1與其特異性位點結(jié)合,使HBP1磷酸化,導(dǎo)致細胞周期G1期停滯[21]。之前的研究發(fā)現(xiàn),不管在體內(nèi)還是體外,造血干細胞暴露于電離輻射中會衰老,且其中的p38、p16表達水平以及ROS含量都會升高[22]。近期,有關(guān)電離輻射誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞衰老的研究發(fā)現(xiàn),細胞每隔3代接受高劑量輻射處理后,其衰老程度加劇,且衰老相關(guān)基因(p16、Bim1)也明顯增加[23]。在接受全腦放射治療的患者中,人們發(fā)現(xiàn)照射后的原代血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)了早衰的現(xiàn)象,且獲得衰老相關(guān)的分泌表型,即促炎因子和趨化因子上調(diào),這些微環(huán)境的變化進一步影響神經(jīng)元的生物學(xué)功能[24]。

3 miRNAs參與輻射誘導(dǎo)細胞衰老的調(diào)控

miRNAs作為一種調(diào)控因子,在細胞衰老以及衰老相關(guān)的疾病中起重要作用。外界環(huán)境的刺激會改變miRNAs的表達水平,其涉及的機制可能與染色質(zhì)重塑和DNA甲基化有關(guān)。輻射后差異表達的miRNAs可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)在的輻射敏感性,特別是輻射的遺傳反應(yīng)機制。大鼠輻射兩周后血清中 miR-144-5p、miR-144-3p、miR-142-5p 和miR-19a-3p的表達水平明顯上調(diào),但這些miRNAs在輻射后的肺中未檢測到[25];miR-96-5p和miR-873-3p參與輻射過程中產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的靶基因的調(diào)控[26]。有研究報道輻射誘導(dǎo)人非小細胞肺癌細胞的早衰與miRNA-34a的表達有關(guān),而且miR-34a對細胞衰老的影響與c-myc的表達水平顯著下調(diào)有關(guān),沉默c-myc會增加miR-34a的表達,表明在輻射誘導(dǎo)的衰老中miR-34a的功能可能與靶向調(diào)控Myc有關(guān)[27]。在輻射處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中,過表達miR-494或miR-99b會增加SA-β-gal的表達,增加G1期阻滯,同時出現(xiàn)組蛋白H2AX的磷酸化以及RB低磷酸化。相反,抑制miR-494或miR-99b會降低SA-β-gal,降低G2期阻滯,激活caspase-3和caspase-7。這些結(jié)果表明miR-494或miR-99b會影響輻射引起的細胞衰老[28]。在輻射引起的人成纖維細胞老化中,沉默信息調(diào)節(jié)因子4(silence information regulator-4,Sirt4)的表達明顯增加,而Sirt4表達水平的上調(diào)與miRNA-15b水平的降低有關(guān)。miR-15b的抑制會使細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS以及衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[29～30]。

近年來人們相繼報道了一些參與輻射誘導(dǎo)衰老的miRNAs。例如:Bae等[31]通過生物信息學(xué)分析得出mmu-miR-291a-3p是一種抗衰老因子,用小鼠胚胎干細胞分泌的mmu-miR-291a-3p處理衰老細胞,發(fā)現(xiàn)衰老細胞中SA-β-gal的表達降低,細胞的增殖潛力增強,同時p53、p21的mRNAs和蛋白質(zhì)表達水平降低。此外,有研究表明miRNAs在p53-p21和p16-pRB通路中特異性過表達或下調(diào),對細胞衰老起重要的調(diào)控作用[32],相關(guān)機制如圖2所示。miR-34是腫瘤抑制子和衰老的觸發(fā)蛋白[33～34],文中以miR-34a為例進行簡要說明。在輻射處理的小鼠中,miR-34a參與p53介導(dǎo)的腫瘤抑制作用。miR-34a過表達會激活p53-p21通路,下調(diào)E2F的表達,抑制細胞增殖,誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)衰老相關(guān)表型[35]。而且,miR-34也可以直接抑制Sirt1的表達,進而促進p21的表達,阻滯細胞周期進程,進一步加速細胞衰老[36]。

4 總結(jié)與展望

圖2 細胞衰老信號通路Fig.2 Cell senescence signaling pathway

輻射導(dǎo)致的細胞衰老主要有3個原因:第一,由于體內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生,從而出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化,使DNA受損;第二,衰老的兩條信號通過p53-p21和p16-RB被激活,使細胞停滯在G1期或G2期;第三,miRNAs對細胞的衰老也起到一定的調(diào)控作用。近年來,以p53-p21和p16-RB這兩條信號通路為突破點,尋找有效治療輻射誘導(dǎo)細胞衰老的靶點被不斷報道,但以miRNAs作為治療靶點預(yù)防正常組織的輻射損傷仍有待研究。盡管相關(guān)研究取得了很大的突破,但仍有許多問題尚未解決,比如:miR-34a在促進細胞衰老的同時也會直接抑制Sirt1的表達[37～38],因此我們并不能認為miR-34a具有促進衰老的作用,這可能與miRNAs靶向調(diào)控多個基因有關(guān)。由于miRNAs功能作用的復(fù)雜性,目前尚無法判斷miRNAs作用的具體靶點,只有探索出miRNAs與靶基因之間的相互作用,不斷完善RNA的研究技術(shù),miRNAs的研究成果才能在醫(yī)療上得到一定的應(yīng)用。