楊 雪 李云亮 陸 峰 王禹程 黃姍芬 段玉清 馬海樂*

（1 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江212013 2 承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北承德067000）

高血壓是常見的慢性心血管疾病，是以動脈血壓持續(xù)升高為特征的“心血管綜合征”，是我國心腦血管病最主要的危險因素[1]。據(jù)估計，截止2025年，高血壓的發(fā)病人數(shù)將超過5 億[2]。高血壓人群中大部分患者是原發(fā)性高血壓，可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （angiotensin I converting enzyme，簡稱ACE）的活性進而有效地控制血壓[3]。研究表明，蛋白質(zhì)通過蛋白酶的ACE 抑制肽，這類多肽可阻礙具有降血壓效果的血管緊張素Ⅱ生成，同時促進緩激肽的釋放，從而起到降血壓的作用[4]。因此，酶法制備ACE 抑制肽成為生物活性肽研究的熱點[5]。

米渣是工業(yè)上提取淀粉和糖的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量較高（干基約占70%）[6]，富含人體必需的氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源。然而，由于米渣蛋白中含有高含量的谷蛋白，此類蛋白幾乎不溶于水，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，大部分作為動物性飼料或者廢棄，并沒有充分利用到米渣蛋白的價值。而多項研究表明，大米蛋白的酶解產(chǎn)物具有很強的ACE 抑制活性[7-8]，若將米渣制備成活性多肽是對其的高值化利用。

目前，酶法制備多肽主要存在酶解效率低的問題，許多研究者采用新型的物理加工技術(shù)-超聲波預(yù)處理將蛋白改性以后再進行酶解可顯著提高蛋白的酶解效率[9-10]。在超聲波的所有參數(shù)中，超聲頻率是影響空化效果的主要因素之一[11]。本文探討不同超聲頻率對大米蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性的影響，同時研究其經(jīng)過胃腸消化之后活性及蛋白含量的變化，為超聲輔助酶解制備大米ACE 抑制肽的領(lǐng)域及其進入體內(nèi)后的ACE 抑制活性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

米渣，湖北京源山生物技術(shù)有限公司（中國湖北）；堿性蛋白酶，酶活257 364.5 U/mL，諾維信有限公司（中國天津）；N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸 （N-[3-（2-furylacryloyl）]-L -phenyalanyl -glycyl -glycine，F(xiàn)APGG），Sigma 公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 （Angiotensin Iconverting enzyme，ACE），參照吳瓊英等[12]的方法制備；試驗中使用的所有試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

雙頻聚能式超聲波設(shè)備，江蘇大學(xué)自主研發(fā)；Tecan Infinite PRO TWIN 200 多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯（TECAN）集團公司；DL-5 臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；FD-1A-50 真空冷凍干燥，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；PHS-3C 精密pH 計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Cary 100 紫外可見分光光度計，美國Varian 公司。

2 試驗方法

2.1 大米蛋白提取

大米蛋白根據(jù)Yang 等[13]的方法提取，略有修改。大米蛋白質(zhì)（80 g）加入到0.25%的NaOH 溶液中，50 ℃攪拌3 h 后，用1.0 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)上清液pH 至4.0 沉淀蛋白，然后在5 000 r/min 條件下離心15 min。將沉淀物重新懸浮于蒸餾水中，將pH 調(diào)節(jié)至7.0，將懸浮液噴霧干燥，4 ℃條件下保存，待用。

2.2 超聲輔助酶解大米蛋白

超聲頻率分別為單頻20，35，40 和50 kHz 工作，雙頻同步或雙頻順序20/28，20/35，20/40 和20/50 kHz 組合，設(shè)定相同的超聲預(yù)處理參數(shù)：底物質(zhì)量濃度50 g/L，溫度30 ℃，時間15 min，間歇比5∶5，超聲功率密度100 W/L。超聲預(yù)處理后按照以下的酶解參數(shù)進行酶解：加酶量為5%（E/S），pH 為8，溫度為50 ℃，酶解時間為90 min，酶解結(jié)束后于沸水浴條件下滅酶10 min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH 至7.0 后，于10 000 r/min 離心10 min，取上清液待測。

2.3 胃腸模擬消化

采用2.2 節(jié)同樣的試驗操作，酶解結(jié)束后于沸水浴條件下滅酶10 min，冷卻至室溫后，進行胃腸模擬消化，試驗參照Ketnawa 等[14]的方法略有修改，調(diào)節(jié)酶解液的pH 值為1.5，加入2%（E/S）的胃蛋白酶，于37 ℃條件下反應(yīng)2 h 模擬胃消化，反應(yīng)結(jié)束后，取出于沸水浴條件下滅酶10 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH 至7.0，待測。同時以同樣的方法模擬胃消化，結(jié)束后迅速調(diào)節(jié)其pH 調(diào)節(jié)至7.5，加入2%（E/S）的胰酶，于37 ℃反應(yīng)4 h 模擬腸消化，反應(yīng)結(jié)束后于沸水中滅酶10 min，冷卻后調(diào)節(jié)pH 至7.0，離心取上清液，待測。

2.4 大米蛋白水解度（DH）的測定

蛋白酶解過程中水解度的計算采用pH-stat方法[15]，其計算公式如下：

式中：h——被裂解的肽鍵數(shù)；htot——常數(shù)，即每個底物中蛋白中含有的肽鍵總數(shù)，大米蛋白為8.4 mmol/g；B——消耗的堿液的體積，mL；N——堿液的濃度，mol/L；α——大米蛋白的平均解離度；m——底物中蛋白質(zhì)總含量，g。

2.5 大米蛋白酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的測定

ACE 抑制活性的測定方法參照丁青芝[16]稍有修改。稱取HEPES 1.910 g，NaCl 1.755 g，加適量的蒸餾水溶解，調(diào)pH 至8.3，加水定容至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗夥Q取FAPGG 19.97 mg，加HEPES 緩沖溶液溶解并定容至50 mL，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。樣品用HEPES 緩沖液稀釋100 倍，ACE用HEPES 緩沖液稀釋80 倍。ACE 抑制活性的測定方法及加樣順序見表1。

表1 ACE 抑制活性的測定方法Table 1 Determination method of ACE inhibitory activity

在340 nm 波長下，分別測定對照孔和樣品孔的初始吸光度（a1和b1），37 ℃保溫30 min 后再測定其吸光度（a2和b2）。對照孔的吸光度減少值A(chǔ)=a1-a2，樣品孔的吸光度減少值B=b1-b2。

ACE 抑制活性的計算公式為：

2.6 多肽含量測定

參考何榮海等[17]的試驗方法略有修改，取1.25 mL 樣品溶液，加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）水溶液，混勻，靜置30 min，然后在10 000 r/min 下離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。取6 mL 上述溶液置于試管中，加入雙縮脲試劑4 mL，混勻后，靜置10 min，1 000 r/min 離心10 min，取上清液于540 nm 下測定OD 值，同時以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照得出樣品溶液中的多肽濃度。

2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用SPSS 13.0 軟件單因素方差分析 （IBM 公司，NY，USA）P＜0.05 的顯著性水平下進行分析。圖表采用OriginPro8（OriginLab 公司，MA，USA）繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同超聲頻率對大米蛋白DH 及其酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響

單頻超聲、 雙頻順序超聲和雙頻同步超聲對大米蛋白DH 及酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響分別見圖1a、圖1b和圖1c。由圖可知，不同的超聲頻率對大米蛋白的DH 無顯著影響 （P＞0.05），但不同的超聲頻率對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性均具有顯著影響（P＜0.05）。由圖1a可知，在單頻超聲頻率為20 kHz 條件下達到最大值，與對照組相比，ACE 抑制活性提高了35.68%。圖1b和c的結(jié)果表明，在20/35 kHz 組合雙頻順序的條件下，蛋白酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性最大，相比于對照組，蛋白酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性提高了66.24%，與單頻20 kHz 超聲相比，其對酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性提高了22.52%。雙頻20/35 kHz 同步超聲較其他超聲順序超聲頻率提高酶解產(chǎn)物ACE抑制活性幅度大，相比于對照提高了56.17%，相比于單頻20 kHz 超聲來說，提高了15.10%。

圖1 單頻（a）、雙頻順序（b）及雙頻同步（c）超聲對大米蛋白水解度及酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響Fig.1 Effect of single-frequency（a），dual-frequency sequential （b）and dual-frequency simultaneous（c）ultrasound on DH of rice protein and ACE inhibitory activity of hydrolysate from rice protein

不同的超聲頻率均可顯著提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，這是由于天然的大米蛋白構(gòu)象存在缺陷，使得其蛋白結(jié)構(gòu)不適于蛋白酶解，超聲波預(yù)處理改變了蛋白的分子構(gòu)象，從而改變了大米蛋白的酶解特性，使得更多的與降血壓活性有關(guān)的活性基團暴露。本試驗的研究結(jié)果表明，雙頻作用效果明顯優(yōu)于單頻作用效果，原因是雙頻超聲組合提供了一個更寬的頻譜作用范圍，其對聲化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)額的提高具有明顯的增強效應(yīng)[18-19]。

在相同的功率消耗下，雙頻順序超聲對大米蛋白酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的增強效果顯著優(yōu)于同步工作的效果。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于：在雙頻同步超聲條件下，兩列不同頻率的超聲波在同步傳播時有可能在某些傳播位置或相位發(fā)生波的干擾，可能會形成抵消的現(xiàn)象，而雙頻順序工作的兩種不同頻率的超聲波，可以對蛋白原料的不同作用靶點，提供間歇式攻擊，不存在抵消的現(xiàn)象[20]。

3.2 不同超聲頻率對蛋白酶解物經(jīng)過胃腸模擬消化后的ACE 抑制活性

單頻超聲、 雙頻順序超聲和雙頻同步超聲對大米蛋白酶解液的胃腸模擬消化產(chǎn)物的ACE 率的影響分別見圖2a、圖2b和圖2c。由圖可知，經(jīng)過胃腸模擬消化，單頻、雙頻同步、雙頻順序超聲均能顯著提高酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性（P<0.05），單頻20 kHz、20/35 kHz 順序超聲和20/23 kHz 同步超聲預(yù)處理后的大米蛋白酶解液的胃腸模擬消化產(chǎn)物的ACE 抑制活性最高，相比于對照組來說，蛋白酶解物的ACE 抑制活性經(jīng)過胃消化后，分別增加了43.54%，59.16%和50.38%，經(jīng)過腸消化后，分別增加了19.83%，34.52%，24.82%。

有研究表明，大豆分離蛋白經(jīng)過體外模擬消化后可產(chǎn)生ACE 抑制肽[21]，煮熟的雞蛋經(jīng)過胃腸道消化液具備ACE 抑制活性[22]。因此，胃腸道消化酶是制備ACE 抑制肽的常用蛋白酶。經(jīng)過胃蛋白酶消化以后，超聲能顯著提高大米蛋白酶解液的ACE 抑制活性，且超聲提高的幅度高于未超聲，說明超聲能提高胃消化階段酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性。與胃消化相比，蛋白酶解物經(jīng)過腸消化以后的ACE 抑制活性反而有所降低。

圖2 單頻（a）、雙頻順序（b）及雙頻同步（c）超聲對大米蛋白酶解液胃腸模擬消化產(chǎn)物ACE 抑制活性的影響Fig.2 Effect of single-frequency （a），dual-frequency sequential （b）and dual-frequency simultaneous （c）ultrasound on ACE inhibitory activity of gastrointestinal simulated digestive products from rice protein hydrolysate

由以上結(jié)果可以看出，超聲對大米蛋白不同階段的酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性具有不同的影響，超聲可顯著提高酶解產(chǎn)物及胃模擬消化產(chǎn)物的ACE 抑制活性，而對于腸消化產(chǎn)物的ACE 抑制活性有所下降。原因可能與胰酶所含蛋白酶種類多，酶切位點較多，導(dǎo)致多肽過度降解，而形成大量無明顯生物學(xué)活性的氨基酸有關(guān)。

3.3 不同超聲頻率對蛋白酶解物及其胃腸模擬消化后的多肽含量

單頻超聲、雙頻順序超聲、雙頻同步超聲對大米蛋白酶解液及胃腸模擬消化產(chǎn)物的多肽含量的影響分別見圖3a、圖3b和圖3c。由圖可知，胃消化后的多肽含量顯著高于未經(jīng)過消化的多肽含量（P<0.05），而經(jīng)過腸消化的多肽含量均低于經(jīng)過胃消化的多肽含量。說明經(jīng)過胃消化，胃蛋白酶將酶解液中的蛋白或長鏈多肽切割為小片段的多肽，而經(jīng)過胰酶酶解，多肽因過度酶解而形成了部分氨基酸，導(dǎo)致多肽含量的降低，而使得ACE 抑制活性降低。

與未超聲相比，超聲可顯著提高堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的多肽含量（P<0.05），從而提高了酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，再經(jīng)過胃蛋白酶消化，其多肽含量進一步增加，ACE 抑制活性也大幅度提升，由此可知，超聲可顯著提高堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物、胃消化產(chǎn)物的多肽含量及ACE 抑制活性。天然的蛋白結(jié)構(gòu)不利于堿性蛋白酶及胃蛋白酶的酶解，因此，超聲預(yù)處理可以促進天然的蛋白結(jié)構(gòu)的伸展，使得蛋白酶與底物接觸的概率增加，大大提高了酶解產(chǎn)物的多肽含量及ACE 抑制活性。然而，酶解產(chǎn)物經(jīng)過腸消化后，蛋白含量反而降低，原因是多肽過度酶解，形成了大量的氨基酸，使得ACE 抑制活性降低。因此，若考慮胃腸消化作用，則說明蛋白在堿性蛋白酶酶解的階段存在過度降解，導(dǎo)致再經(jīng)過胃和腸道的兩次消化以后，反而又出現(xiàn)降低的趨勢。因此，若充分利用胃腸的消化功能，可通過調(diào)節(jié)在體外（本文為堿性蛋白酶的酶解過程）酶解的程度，使酶解物在腸消化以后，產(chǎn)物的ACE 抑制活性和多肽含量達到最大值。

圖3 單頻（a）、雙頻順序（b）及雙頻同步（c）超聲對大米蛋白酶解液及胃腸模擬消化產(chǎn)物多肽含量的影響Fig.3 Effect of single-frequency （a），dual-frequency sequential （b）and dual-frequency simultaneous （c）ultrasound on the peptide content of rice protein hydrolysate and gastrointestinal simulated digestive product

4 結(jié)論

本文研究了不同的超聲頻率預(yù)處理大米蛋白對堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物以及胃腸道模擬消化產(chǎn)物的ACE 抑制活性的影響，以及不同階段大米蛋白酶解產(chǎn)物的多肽含量。主要結(jié)論如下：

1）相同的功率消耗下，不同超聲頻率顯著提高大米蛋白酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性，雙頻超聲較單頻超聲更能提高大米蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，并且雙頻順序超聲對酶解產(chǎn)物ACE 抑制活性的增強效果顯著優(yōu)于同步超聲的效果；

2）通過超聲輔助酶解大米蛋白制備ACE 抑制肽的研究，發(fā)現(xiàn)適合大米蛋白酶解制備ACE 抑制肽的超聲波頻率為20 kHz 和20/35 kHz；

3）超聲預(yù)處理的大米蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)過胃腸模擬消化后，其ACE 抑制活性和多肽含量均呈現(xiàn)出在胃消化后升高，而腸消化后降低的變化趨勢。