王 磊， 時軍利， 王春青， 李炳慶

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 承德 067000

莫羅尼鼠白血病病毒前病毒整合(PIM)激酶家族是一類可編碼絲/蘇氨酸蛋白酶的原癌基因，包括PIM1、PIM2和PIM3三個成員，可通過磷酸化相關(guān)特異性底物的方式，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1-2]。既往研究[3-4]證實，PIM在胰腺癌、星形細(xì)胞瘤和乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮原癌基因的作用，而干擾其表達(dá)可影響癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。已有研究[5-6]證實，PIM1和PIM3均在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用；PIM2在結(jié)腸癌中高表達(dá)，在提高葡萄糖利用率、有氧糖酵解和能量生成方面發(fā)揮重要作用，但其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用尚不完全清楚。因此，本研究以結(jié)腸癌HT29細(xì)胞為研究對象，通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾沉默PIM2表達(dá)，觀察其在體外對HT29細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡的影響，以期為結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460和結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29購自美國ACTT。RPMI 1640培養(yǎng)基和特級胎牛血清購自法國BIOWEST LTD公司，脂質(zhì)體2000、Trizol試劑和凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司，青霉素和細(xì)胞裂解液購自美國Sigma公司，鏈霉素和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，兔抗人PIM2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗人β-actin抗體購自美國Sigma-Aldrich公司。CCK-8試劑盒購自上海Dojindo Molecular Technologies公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自美國Takara公司。DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific Pierce公司。含PIM2 shRNA(5′-GUGCCAAACUCAUUGAUUUTT-3′)慢病毒載體及含無意義錯配序列的空載體慢病毒由吉滿生物科技公司包裝完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與慢病毒感染將NCM460和HT29細(xì)胞接種至含青鏈霉雙抗和質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃的體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。將HT29細(xì)胞以每孔2×105個細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板上，使用含胎牛血清的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜。實驗分為：空白組(未感染)、陰性組(空載體慢病毒感染)和實驗組(PIM2 shRNA慢病毒感染)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時，將病毒稀釋液(MOI=30)根據(jù)實驗分組加入到HT29細(xì)胞中，感染5 d。當(dāng)感染效率達(dá)80%時，繼續(xù)孵育48 h。加入4 μg/ml 嘌呤霉素篩選獲取PIM2表達(dá)沉默的HT29細(xì)胞株，采用實時熒光定量PCR和Western blotting方法檢測HT29細(xì)胞中PIM2的感染效果。

1.3 實時熒光定量PCR測定PIM2 mRNA的表達(dá)收集待檢測的HT29和NCM460細(xì)胞，使用Trizol試劑抽提獲取總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計內(nèi)參β-actin引物：F：5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′和R：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′及PIM2引物：F：5′-ACTCCAGGTGGCCATCAAAG-3′和R：5′-TCCATAGCGTGCGACTTCG-3′。取濃度為10 μmol/L的上下游引物各0.6 μl、cDNA 1 μl、SYBR Green染料10 μl，加入ddH2O至25 μl反應(yīng)體系。上PCR儀后，按照起始溫度95 ℃預(yù)變性5 min，接著35個循環(huán)：95 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s擴(kuò)增。采用2-ΔΔCT法計算HT29細(xì)胞中PIM2 mRNA的相對表達(dá)量。重復(fù)測定3次。

1.4 Western blotting方法測定PIM2蛋白表達(dá)向待測的HT29或NCM460細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白后，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與2×蛋白Loading Buffer混勻沸水浴加熱變性3 min。將制備的SDS-PAGE凝膠放入電泳槽使其沒過電泳液后，按照每孔60 μg上樣。電泳至分離后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)封閉液(質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉)室溫封閉1 h后，將膜放入封閉液稀釋1 000倍的一抗中室溫孵育2 h。接著放入封閉液稀釋2 000倍的二抗中室溫孵育1 h。經(jīng)封閉液洗滌后，以底物DAB呈色顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。重復(fù)測定3次。

1.5 CCK-8法測定細(xì)胞增殖收集慢病毒感染24 h、48 h、72 h后的空白組、陰性組和實驗組的HT29細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104ml-1。按照每孔100 μl接種至96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液作用4 h。在492 nm波長處以酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各組細(xì)胞的光密度值。重復(fù)測定3次。

1.6 Transwell實驗測定細(xì)胞侵襲與遷移收集慢病毒感染的各組HT29細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基制備濃度為3×104ml-1單細(xì)胞懸液。在基質(zhì)膠包被或未包被的Transwell小室上室中加入200 μl細(xì)胞液，下室內(nèi)加入500 μl培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清)。放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，取出小室。小心拭去濾膜上層未穿透的細(xì)胞，以質(zhì)量濃度為40 g/L甲醛溶液固定下層穿膜細(xì)胞后，5 g/L結(jié)晶紫對細(xì)胞進(jìn)行染色。磷酸緩沖液洗膜后，置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計隨機(jī)選取的5個視野中的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)測定3次。

1.7 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡收集慢病毒感染48 h后的實驗組、陰性組和空白組HT29細(xì)胞，在預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌2次后，加入結(jié)合緩沖液使細(xì)胞濃度為3×104ml-1。加入各5 μl Annexin V-FITC和PI工作液避光反應(yīng)15 min。補(bǔ)加結(jié)合緩沖液500 μl，上機(jī)檢測各組細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果

2.1 PIM2在結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中高表達(dá)及慢病毒感染后成功下調(diào)其表達(dá)實時熒光定量PCR檢測人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中PIM2 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.98±0.05和6.18±0.02；Western blotting方法檢測PIM2蛋白的相對表達(dá)量分別為 0.13±0.02和0.82±0.06(見圖1A)。與NCM460細(xì)胞相比，HT29細(xì)胞PIM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(tmRNA=27.339，P=0.000；t蛋白=146.790，P=0.000)。慢病毒感染HT29細(xì)胞后，實時熒光定量PCR和Western blotting方法檢測空白組、陰性組和實驗組細(xì)胞中PIM2 mRNA和蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖1B和表1所示，與空白組相比，陰性組細(xì)胞的PIM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而實驗組中PIM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

2.2 下調(diào)PIM2表達(dá)抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖陰性組在不同時間點下的增殖能力與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但實驗組細(xì)胞從48 h開始增殖活力較空白組明顯降低(P<0.05)(見表2)。

2.3 下調(diào)PIM2表達(dá)抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞侵襲和遷移實驗組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)較空白組均顯示減少(P<0.05)，但陰性組與空白組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2、表3)。

圖1 Western blotting方法檢測結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中PIM2蛋白的表達(dá)
A：PIM2蛋白在人正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞和結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中的表達(dá)；B：慢病毒感染后各組HT29細(xì)胞中PIM2蛋白的表達(dá)

Fig 1 The expression of PIM2 protein in colorectal cancer cells detected by Western blottingA: expression of PIM2 protein in human normal colon epithelium NCM460 cells and colorectal cancer HT29 cells; B: expression of PIM2 protein in HT29 cells of each group after lentivirus infection

2.4 下調(diào)PIM2表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡與空白組相比，陰性組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但實驗組中細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(見圖3、表3)。

表1 各組HT29細(xì)胞中 PIM2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量 Tab 1 The relative expressions of PIM2 mRNA and protein in SGC7901 cells of each group

注：與空白組相比，*P<0.05。

表2 各組HT29細(xì)胞的光密度值Tab 2 Optical density of HT29 cells in each group

注：與同時間點空白組相比，*P<0.05。

圖2 各組中侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)Fig 2 Comparison of the number of invasive cells, migrating cells in each group

表3 各組中侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率的比較 Tab 3 Comparison of the number of invasive cells, migrating cells and apoptotic rate in each group

注：與空白組相比，*P<0.05。

3 討論

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率上升十分明顯的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因的異常失活和原癌基因的激活等關(guān)系密切[7-8]，深入研究結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制，明確引起結(jié)腸癌惡性進(jìn)展的原因，對靶向治療結(jié)腸癌具有重要意義。

PIM家族是一種與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的原癌基因，其成員PIM1和PIM3被證實在腫瘤中異常表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)功能發(fā)揮致癌作用[9]。PIM2是PIM家族中另一成員，其在腫瘤進(jìn)展中的作用引起學(xué)者們的關(guān)注。UDDIN等[10]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)PIM2通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子促進(jìn)Stat3的活化，靶向抑制PIM2表達(dá)可通過抑制Zeb1抑制乳腺癌EMT相關(guān)的遷移和侵入性；同時，ZHAO等[11]研究證實，使用PIM2特異性抑制劑可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。LIU等[12]研究指出，通過短干擾RNA下調(diào)PIM2表達(dá)可通過p53非依賴性p21信號通路抑制了白血病K562細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌H1299和A549細(xì)胞的增殖并延遲的G0/G1細(xì)胞周期進(jìn)展。WEIRAUCH等[13]通過敲除PIM1、PIM2和PIM3，比較發(fā)現(xiàn)三者均有抗肝癌細(xì)胞增殖和促凋亡的作用，但PIM2基因敲除對細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和凋亡的影響最為顯著?？梢姡琍IM2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而靶向抑制其表達(dá)有望成為腫瘤治療的新手段。

圖3 流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞的凋亡結(jié)果Fig 3 Apoptosis results in each group detected by flow cytometry assay

ZHANG等[6]研究指出，PIM2在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，在提高葡萄糖利用率、有氧糖酵解和能量生成過程中發(fā)揮重要作用，同時敲除其表達(dá)可降低癌細(xì)胞的能量生成，增加了其對凋亡的敏感性。本研究以結(jié)腸癌HT29細(xì)胞為研究對象，檢測證實了PIM2在HT29細(xì)胞中的高表達(dá)；通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)HT29細(xì)胞中PIM2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，HT29細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力均明顯減弱，而細(xì)胞凋亡能力明顯增強(qiáng)。結(jié)合上述PIM2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的促癌作用，結(jié)果提示,結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中高表達(dá)PIM2可通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及抑制凋亡發(fā)揮致癌作用。

綜上所述，PIM2在結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；然而，PIM2在體內(nèi)對結(jié)腸癌生長的作用還有待后期進(jìn)一步深入的研究。