張麗嬌，趙彤彤，梁云霞，王春芳，王春鳳，錢愛東

(1. 長春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130032 ; 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春130000)

目前非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculous Mycobacterium，NTM)感染及其致病性越來越受到重視，有報道證實，新金色分枝桿菌可引發(fā)肺部感染，嗜血分枝桿菌引發(fā)眼內(nèi)炎、淚囊炎和頸面部淋巴結(jié)炎等等[1-5]。分枝桿菌感染機體后，第一步感染巨噬細(xì)胞，通過與宿主細(xì)胞的斗爭最終存活下來，并且增殖[6]。但關(guān)于NTM與巨噬細(xì)胞的相互作用方面研究尚少，本試驗主要觀察由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫與微生物實驗室分離鑒定出來的胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌對巨噬細(xì)胞系RAW264.7凋亡率及TNF-α及IL-10表達(dá)的影響，并且觀察了這2株菌在小鼠巨噬細(xì)胞中的吞噬及增殖情況。對進一步明確NTM與宿主巨噬細(xì)胞的作用機制以及NTM疾病的發(fā)病機理、制定治療措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 1株胞內(nèi)分枝桿菌，1株偶發(fā)分枝桿菌均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)免疫與微生物實驗室分離鑒定；C57BL/6小鼠，雌性，6周齡，北京華阜康生物科技股份有限公司； RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清，Hyclone公司；7H9 培養(yǎng)基，BD公司；Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；熒光素雙醋酸酯(FDA)，Sigma公司；AnnexinV/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，BD公司；TNF-α、IL-10的ELISA檢測試劑盒，R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌在小鼠巨噬細(xì)胞中的吞噬及增殖 按常規(guī)方法制備小鼠骨髓巨噬細(xì)胞[7]，接種至24孔板( 5×105個/孔)。分成胞內(nèi)分枝桿菌組、偶發(fā)分枝桿菌組及空白對照組，菌體( 5×106個/孔)與巨噬細(xì)胞作用2 h 后，清洗，加入 RPMI1640 培養(yǎng)基(含阿米卡星 20 μg/mL)，在感染后的 1、3、5、7 d，以 PBS (含0.1% Triton X-100) 裂解細(xì)胞，收集菌體。7H9 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，檢測胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌在細(xì)胞中的增殖數(shù)量，計算吞噬率，吞噬率=被吞噬的菌數(shù)/細(xì)胞總數(shù)[8-9]。另外，感染1 d時收集的菌體，用FDA(0.5 μg/mL)染色，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌對巨噬細(xì)胞系RAW264.7凋亡率的影響 RAW264.7細(xì)胞(5×105個/孔)放在12孔培養(yǎng)板中，分成胞內(nèi)分枝桿菌組、偶發(fā)分枝桿菌組及空白對照組，培養(yǎng)24 h后在每孔加細(xì)菌5×106個。4 h后，用PBS洗去沒有被吞噬的菌體，加入培養(yǎng)基，其中含阿米卡星(20 μg/mL)，之后使用AnnexinV/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，流式細(xì)胞儀檢測不同時間(0 h、4 h、12 h、24 h、48 h)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌對RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-10表達(dá)的影響 按照說明書用ELISA法檢測RAW264.7細(xì)胞感染后各組不同時間點(0 h、4 h、12 h、24 h、48 h)培養(yǎng)上清中TNF-α及IL-10的表達(dá)，最后用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測OD值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 作圖及數(shù)據(jù)分析用Graphpad Prism 5.0軟件。組間差異用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌在小鼠巨噬細(xì)胞中的吞噬及增殖 感染第1天，2株NTM都被小鼠骨髓巨噬細(xì)胞所吞噬，胞內(nèi)分枝桿菌的吞噬率高于偶發(fā)分枝桿菌(表1)。在倒置熒光顯微鏡下同樣觀察到2株NTM被巨噬細(xì)胞吞噬(見中插彩版圖1)。

圖1 NTM在小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中的吞噬情況

a： 胞內(nèi)分枝桿菌 ； b： 偶發(fā)分枝桿菌

2株菌感染3、5、7 d后增殖明顯，胞內(nèi)分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中增殖速度比偶發(fā)分枝桿菌快(P<0.01)(圖2)。

表1 非結(jié)核分枝桿菌感染小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的吞噬率

與偶發(fā)分枝桿菌組比較, *P<0.05

圖2 NTM在小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中的增殖情況

2.2 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌對巨噬細(xì)胞系RAW264.7凋亡率的影響 如圖3所示，感染0 h，胞內(nèi)分枝桿菌組、偶發(fā)分枝桿菌組及空白對照組差異不顯著。隨著時間延長，各感染組凋亡率開始升高，與空白對照組差異極顯著(P<0.001)，其中偶發(fā)分枝桿菌組凋亡率升高最明顯，其次是胞內(nèi)分枝桿菌組。凋亡率的高低可能與菌體毒力有關(guān)。

2.3 胞內(nèi)分枝桿菌及偶發(fā)分枝桿菌對RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-10表達(dá)的影響 收集RAW264.7細(xì)胞上清液ELISA法檢測TNF-α、IL-10表達(dá)的變化，在 4 h、12 h，胞內(nèi)分枝桿菌組及偶發(fā)分枝桿菌組TNF-α的表達(dá)值與空白對照組相比都較高，差異顯著(P<0.05)，并且胞內(nèi)分枝桿菌組TNF-α的表達(dá)量高于偶發(fā)分枝桿菌組，差異顯著(P<0.05)；但在24 h、48 h，2個試驗組TNF-α表達(dá)值下降明顯，與對照組差異不顯著(P>0.05)(圖4)。在4 h、12 h，胞內(nèi)分枝桿菌組及偶發(fā)分枝桿菌組IL-10的表達(dá)值與空白對照組相比都較高，差異顯著(P<0.05)，并且下降不明顯，保持高表達(dá)，并且胞內(nèi)分枝桿菌組IL-10的表達(dá)量高于偶發(fā)分枝桿菌組，差異顯著(P<0.05)(圖5)。

圖3 NTM對巨噬細(xì)胞凋亡率的影響

圖4 NTM對RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

與空白對照組比較， *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001

圖5 NTM對RAW264.7細(xì)胞IL-10表達(dá)的影響

與空白對照組比較， *P<0.05 ,**P<0.01 ,***P<0.001

3 討論

有研究證明，結(jié)核分枝桿菌強毒株在巨噬細(xì)胞中的存活及繁殖能力要高于弱毒株[10]。因此，分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的生存狀態(tài)及數(shù)量可以作為評價菌株毒力高低的一個重要指標(biāo)；有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔巨噬細(xì)胞對強毒株H37Ra的吞噬率高于滅活菌H37Rv[9]，說明巨噬細(xì)胞對分枝桿菌的吞噬率也是驗證菌體毒力及易感性的一個重要標(biāo)準(zhǔn)。

為了探究非結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后的增殖情況，我們觀察了小鼠骨髓巨噬細(xì)胞吞噬胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌的情況，并且在1、3、5、7 d檢測NTM在巨噬細(xì)胞中的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同菌體感染后的增殖情況各有不同，可能與其毒力有關(guān)，在感染過程中2株菌都被吞噬并在細(xì)胞中增殖，胞內(nèi)分枝桿菌相比于偶發(fā)分枝桿菌吞噬數(shù)量及增殖都更為顯著。我們推測胞內(nèi)分枝桿菌毒力及易感性均高于偶發(fā)分枝桿菌。

巨噬細(xì)胞通過凋亡來抑制菌體的感染是一種常見的方式，有相關(guān)研究表明，不同的菌體感染巨噬細(xì)胞后引起的凋亡率不同[11-13]。這可能與菌體的毒力相關(guān)，但菌體種類繁多，我們還需要深入研究相關(guān)機制。因此，我們用胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示，胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌都引起了巨噬細(xì)胞的凋亡。胞內(nèi)分枝桿菌組凋亡率高于偶發(fā)分枝桿菌組。更進一步說明凋亡率和毒力的關(guān)系，推測是由于胞內(nèi)分枝桿菌的毒力更強所以引起的凋亡率反而更低。

分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后，會引起很多細(xì)胞因子的分泌，TNF-α屬于炎性細(xì)胞因子，促進保護性免疫[14]。而IL-10屬于抑制性細(xì)胞因子，阻礙細(xì)胞免疫[15]。我們分析了這2個重要的細(xì)胞因子在胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞過程中的變化。結(jié)果顯示，在感染初期，胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌都引起了這2種細(xì)胞因子的高表達(dá)，顯著高于空白對照組，但后期，TNF-α的表達(dá)量開始下降，而IL-10持續(xù)高表達(dá)。IL-10持續(xù)高表達(dá)有可能是炎性因子TNF-α表達(dá)下降的原因。并且胞內(nèi)分枝桿菌在整個過程中細(xì)胞因子的表達(dá)量都較高，這也可能與毒力相關(guān)。

目前關(guān)于NTM與巨噬細(xì)胞相互作用的機制的研究還不夠深入，本試驗為NTM與宿主巨噬細(xì)胞調(diào)控作用的機制研究奠定基礎(chǔ)。