何亞鵬，陳怡靜，時 曉，張寶莉，溫戰(zhàn)華，陳春山，李 博，杜迎春

(1.北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京 102100；2.鄭州外國語新楓楊學(xué)校，鄭州450000)

傳染性造血器官壞死病(infectious haematopoietic necrosis，IHN)是極易對冷水魚養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害的魚類急性全身性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定必須申報的動物疫病，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為二類動物疫病，是第1類魚類口岸檢疫疫病[1]。目前，該病在法國、意大利、德國、英國、日本、韓國、俄羅斯和中國等國家暴發(fā)，已形成全球分布；在我國，自1985年東北地區(qū)首次報道IHN以來，該病在北京、河北、遼寧、吉林、山東、甘肅、青海、四川、新疆、云南等省、市、自治區(qū)均有分布，并有向周圍蔓延的趨勢[2-4]。IHN的病原為彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬的傳染性造血器官壞死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)，其病毒形態(tài)為子彈狀，有囊膜包被[4]。IHNV主要危害鮭鱒魚類的魚苗及幼魚，魚苗死亡率極高，可達(dá)100%[1，3]。

IHN可通過臨床和病理診斷進(jìn)行初步判斷，確診則需要進(jìn)一步的實驗室檢測。目前檢測IHNV的方法主要病毒分離培養(yǎng)、抗體中和試驗、免疫組化法、ELISA以及RT-PCR等方法。這些方法一般費時費力，且對試驗平臺要求很高，需要一些專業(yè)的設(shè)備[5-7]。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP)節(jié)省實驗步驟，具有操作簡便、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，不需很專業(yè)的儀器設(shè)備，在水浴鍋中即可完成擴(kuò)增，特別適用于基層及現(xiàn)場快速診斷[8]。本研究針對IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定區(qū)域設(shè)設(shè)計3對特異性引物，并在反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶的作用下對靶序列進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，建立了簡單、快速、靈敏度高、特異性好的IHNV檢測方法，豐富了實驗室和現(xiàn)場檢測IHNV的手段，對IHN快速診斷及防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

病毒RNA提取試劑盒StarSpin Viral RNA Kit購于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker、2×Es Taq MasterMix購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、Bst 2.0 DNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶購自NEB公司；IHNV BJSY株(Genbank登錄號：MH374162)由本實驗室分離保存，鯉春病毒血癥病毒(spring viraemia of carpvirus，SVCV)、牙鲆彈狀病毒(hirame rhabdovirus virus，HRV)滅活病毒液購自ATCC，病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)滅活病毒購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 RT-LAMP引物設(shè)計與合成

對GenBank 收錄的IHNV N基因的多條基因序列進(jìn)行比對，選取特異性保守區(qū)段，利用在線軟件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)針對N基因保守區(qū)設(shè)計3對RT-LAMP專用引物，序列見表1，引物由華大基因公司合成。將引物均稀釋為20 pmol/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 N基因RT-LAMP引物序列

1.3 病毒RNA的提取

取200 μL病毒液于無RNA酶的離心管中，用StarSpin病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA，分裝，使用A one超微量全光譜分光光度計(北京同立創(chuàng)輝儀器有限公司)，測定提取到的病毒樣品的RNA濃度，用DEPC處理水稀釋RNA樣品為10 μg/μL，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-LAMP檢測方法的建立及優(yōu)化

建立25 μL的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系。體系包含對應(yīng)于N基因的6 條引物：F3-N與B3-N各0.5 μL；FIP-N與BIP-N各2 μL；LF-N與LB-N各1 μL、dNTP(10 nmol/L) 2.5 μL，10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L(NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100] 2.5 μL，8 U Bst 2.0 DNA 聚合酶，10 U AMV 反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL IHNV的RNA樣品(10 μg/μL)，無RNA 酶水補(bǔ)齊至25 μL，混勻，同樣的體系設(shè)立5個樣品，編號1～5。將5個樣品分別在61、62、63、64、65 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)35 min，隨后都轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴2 min用以滅活Bst DNA聚合酶。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物各加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化判斷結(jié)果。取5 μL產(chǎn)物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，確定最佳反應(yīng)溫度。

1.5 RT-LAMP特異性實驗

分別取IHNV、SVCV、HRV 和VHSV基因組RNA(10 μg/μL)各1 μL為模板，分別構(gòu)建RT-LAMP體系，利用建立的RT-LAMP檢測方法，進(jìn)行特異性對比實驗，同時以去離子水為模板，相同體系和條件反應(yīng)作為陰性對照。擴(kuò)增結(jié)束后產(chǎn)物加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結(jié)果。

1.6 RT-LAMP靈敏性實驗

將提取的IHNV的RNA(10 μg/μL)10倍梯度稀釋成濃度為1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的病毒RNA,各取1 μL分別構(gòu)建RT-LAMP體系，采用優(yōu)化過的條件進(jìn)行檢測，進(jìn)行靈敏性試驗。擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，輕輕震蕩，直接觀察反應(yīng)液顏色變化，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，對比檢測結(jié)果，得出該方法能檢測出的IHNV的核酸的最低濃度。

1.7 重復(fù)性試驗

利用建立的RT-LAMP 檢測方法，在不同時間，對同一陽性IHNV的RNA樣品進(jìn)行檢測，以驗證本方法的穩(wěn)定性。

1.8 RT-LAMP的臨床檢測

從河北省多個虹鱒魚養(yǎng)殖場采集疑似患IHN的幼魚，挑選9條分別采集肝組織，用StarSpin病毒RNA提取試劑盒提取RNA，編號1～10，分別取1 μL的1～10號RNA樣品利用本試驗建立的IHNV的RT-LAMP進(jìn)行檢測，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證檢測結(jié)果；同時該1～10號RNA樣品利用之前已經(jīng)建立的IHNV的RT-PCR方法進(jìn)行檢測[9]，先用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為為模板，上游引物為5′-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3′，下游引物為5′-CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3′，目的片段為825 bp，PCR 程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。觀察結(jié)果，對比分析該方法在臨床檢測上的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

將5組25 μL反應(yīng)體系分別在61、62、63、64、65 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)35 min，隨后轉(zhuǎn)移至80 ℃水浴2 min，加入1 μL 50倍稀釋的SYBR Green I，混勻，觀察顏色變化。結(jié)果顯示，當(dāng)擴(kuò)增溫度為61、62 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后仍為SYBR Green I的原始顏色紅棕色(圖1a)，電泳沒有出現(xiàn)階梯狀電泳條帶(圖1b)；在63、64 和65 ℃時擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后變?yōu)闊晒饩G色(圖1a)，電泳出現(xiàn)階梯狀電泳條帶(圖1b)。該顯色結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果相符，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，結(jié)果一致，表明該方法在溫度為63、64 和65 ℃可以有效擴(kuò)增。本試驗采用64 ℃為該方法最佳擴(kuò)增溫度。

圖1 RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 RT-LAMP特異性實驗

IHNV、SVCV、HRV和VHSV同屬水生動物彈狀病毒，病毒基因組結(jié)構(gòu)相似，IHNV和VHSV均可感染鮭鱒魚類，RT-LAMP方法也容易受到相似核酸模板和一些污染物的干擾，出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增[8-9]。因此本試驗利用SVCV、HRV、VHSV和ddH2O作對照檢測該RT-LAMP檢測方法的特異性。結(jié)果顯示，以IHNV的RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增后，產(chǎn)物加入SYBR Green I混勻變?yōu)闊晒饩G色(圖2a)，凝膠結(jié)果呈特異性階梯狀條帶(圖2b)；以SVCV、HRV、VHSV和ddH2O為模板相同體系和條件進(jìn)行RT-LAMP檢測，產(chǎn)物呈紅棕色(圖2a)，凝膠電泳無特異性階梯狀條帶出現(xiàn)，結(jié)果為陰性(圖2b)。進(jìn)行3次重復(fù)試驗，結(jié)果一致，說明本試驗建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的特異性。

圖2 RT-LAMP特異性檢測結(jié)果

2.3 RT-LAMP靈敏性實驗

分別以1.0、1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5μg/μL的IHNV的RNA為模板，利用建立的RT-LAMP檢測方法，分析該檢測方法的靈敏性。擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I后觀察顏色變化，取5 μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察驗證可視化檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，當(dāng)病毒RNA濃度為1.0～1.0×10-4μg/μL時，取1 μL為模板，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物在加入SYBR Green I 后變成熒光綠色(圖3a)，電泳特異性階梯狀條帶(圖3b)，當(dāng)1.0×10-5μg/μL，產(chǎn)物加入SYBR Green I ，顏色不變，仍為紅棕色(圖3a)，電泳未出現(xiàn)特異性階梯狀條帶(圖3b)，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，結(jié)果一致，說明本試驗建立的RT-LAMP檢測方法具有較高的靈敏度，可以檢測濃度不低于1.0×10-4μg/μL的IHNV的RNA。

圖3 RT-LAMP靈敏性試驗檢測結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗

經(jīng)過3次重復(fù)性試驗，結(jié)果均一致，證明本試驗所建立的RT-LAMP檢測方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 RT-LAMP臨床應(yīng)用檢測結(jié)果

臨床上采集的10個樣品提取的的RNA樣品利用本試驗建立的IHNV的RT-LAMP進(jìn)行檢測，同時利用之前已建立的IHNV的RT-PCR檢測方法作為對比試驗，結(jié)果表明，4號、9號樣品呈現(xiàn)熒光綠色，樣品中檢出IHNV，其余8個樣品檢測結(jié)果呈紅棕色(圖4a)，未檢測出IHNV，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果也表明4號、9號樣品出現(xiàn)電泳特異性階梯狀條帶(圖4b)，為IHNV陽性，其余8個樣品為陰性。該實驗結(jié)果與之前已建立的檢測IHNV的RT-PCR方法的結(jié)果一致，4號、9號樣品出現(xiàn)825 bp的條帶(圖4c)，證明了該RT-LAMP方法可在臨床上進(jìn)行應(yīng)用。

圖4 臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

我國近幾年冷水魚養(yǎng)殖發(fā)展迅速、前景廣闊，但I(xiàn)HN在我國多地的冷水魚養(yǎng)殖場持續(xù)爆發(fā)，由我國東北、東部、中部各省市向西北、西南各省蔓延，對冷水魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅[1,3]。為保障我國冷水魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，需要警惕IHN的爆發(fā)，采用先進(jìn)方法快速確定病原，及時做好防控。LAMP技術(shù)由于其簡單易于操作，結(jié)果可靠，所以逐步被廣泛應(yīng)用于病原體檢測，國內(nèi)外已建立多種檢測病毒的LAMP方法[10,11]。該方法利用特異性識別靶序列的3對引物及一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，可以在恒溫條件進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，克服了PCR方法需要通過反復(fù)的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，避免了對PCR儀的依賴，節(jié)省了反復(fù)升降溫的時間[8]。本試驗針對IHNV的保守序列核蛋白基因N的特定區(qū)域設(shè)計3對特異性引物，建立IHNV的反轉(zhuǎn)錄LAMP檢測方法，優(yōu)化反應(yīng)溫度，選取64 ℃為該方法最佳擴(kuò)增溫度；在特異性實驗檢測中，利用IHNV與3種同屬水生動物彈狀病毒(SVCV、HRV、VHSV)提取的核酸進(jìn)行特異性實驗，IHNV能在短時間內(nèi)檢測出來，而同屬水生動物彈狀病毒均無擴(kuò)增；靈敏度試驗結(jié)果表明本RT-LAMP檢測方法最低可檢出1.0×10-4μg/μL的IHNV核酸，與RT-PCR檢測方法的靈敏度相當(dāng)；臨床上檢測效果很好，適合推廣應(yīng)用。

RT-LAMP方法可以利用熒光染料直接染色，并通過染料顏色的變化或者凝膠電泳方法判定結(jié)果。有研究利用濁度分析儀檢測LAMP的焦磷酸鹽沉淀來判定檢測結(jié)果，但在實際中使用該方法的檢測靈敏度較差，不如熒光染料法和電泳法[12]。因此本試驗采用熒光染料法和電泳法結(jié)合進(jìn)行結(jié)果分析，更能直觀地觀察到待測樣品的檢測結(jié)果，相互驗證。LAMP方法簡單快捷，具有很多優(yōu)點，適用于基層及現(xiàn)場快速診斷，但由于LAMP方法的擴(kuò)增非常高效，容易使空氣中很容易形成核酸片段的氣溶膠污染，在封閉環(huán)境長期檢測同類樣品時容易出現(xiàn)假陽性，因此需要特別注意，防止管內(nèi)的核酸片段擴(kuò)散到封閉環(huán)境的空氣中[12]。所以如果需要封閉環(huán)境長期檢測同類樣品，可以在進(jìn)行反應(yīng)之前將稀釋的SYBR Green I小心加到裝有樣品的PCR管蓋上，待反應(yīng)結(jié)束后，不開蓋，直接離心，SYBR Green I落入管底，漩渦震蕩混勻即可觀察顏色變化，這樣可防止開蓋引起的氣溶膠污染，避免假陽性的出現(xiàn)。

綜上所述，本研究建立的檢測IHNV的RT-LAMP檢測方法，具有操作簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點，不需很專業(yè)的儀器設(shè)備，在水浴鍋中即可完成擴(kuò)增，適用于基層及現(xiàn)場快速診斷，豐富了實驗室和現(xiàn)場檢測IHNV的手段，對鮭鱒魚苗的引種、無特定病原體種魚的培育、鮭鱒無公害健康養(yǎng)殖，以及IHN的快速檢測及防控均有重要意義。