杜瑋

4月4日，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室運(yùn)營(yíng)的網(wǎng)站bioRxiv發(fā)表論文稱(chēng)，普渡大學(xué)的科研人員發(fā)現(xiàn)了一種名為NgAgo的蛋白能切割DNA（脫氧核糖核酸）， 并可以提高大腸桿菌體內(nèi)基因同源重組的效率。bioRxiv是免費(fèi)向生物學(xué)家開(kāi)放的預(yù)印本文獻(xiàn)庫(kù)，也就是說(shuō)，發(fā)表在上面的文章都是尚未獲得同行評(píng)議的作者原始文稿。

韓春雨。

在基因編輯過(guò)程中，同源重組被視為細(xì)胞常用的修復(fù)手段，基因剪刀斷開(kāi)DNA鏈條的行為，會(huì)刺激同源重組的發(fā)生，如果再提供外源供體，則能完成DNA序列的交換。三個(gè)月前，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)也在國(guó)際期刊《核酸研究》上發(fā)文，同樣稱(chēng)NgAgo能促進(jìn)幾種細(xì)菌體內(nèi)的基因同源重組，可視為潛在的基因編輯工具。

NgAgo，正是兩年多以前，讓河北科技大學(xué)副教授韓春雨卷入巨大輿論漩渦的物質(zhì)。如今，伴隨著兩篇新論文的發(fā)表，由韓春雨首次發(fā)現(xiàn)并命名的NgAgo能否作為基因編輯的新剪刀，再度成了被關(guān)注的焦點(diǎn)。

說(shuō)NgAgo繞不開(kāi)韓春雨

2016年5月2日，《自然》雜志子刊《自然·生物技術(shù)》刊登了一篇名為《DNA引導(dǎo)的NgAgo蛋白可用作基因編輯工具》的文章，作者為河北科技大學(xué)韓春雨團(tuán)隊(duì)，這是NgAgo首次被提出。文章稱(chēng)，NgAgo能在向?qū)NA的指引下，對(duì)目標(biāo)基因有效切割，可用于對(duì)人類(lèi)細(xì)胞的基因編輯。

這篇文章發(fā)表后，在種種外界因素的推動(dòng)下，隨即在國(guó)內(nèi)引發(fā)轟動(dòng)效應(yīng)，某些國(guó)內(nèi)專(zhuān)家和媒體稱(chēng)之為“諾獎(jiǎng)級(jí)”的發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，NgAgo被視為新的基因編輯技術(shù)，可比肩目前世界上應(yīng)用最廣泛的基因編輯工具CRISPR/Cas9。

基因編輯，指人為對(duì)DNA片段進(jìn)行有目的的改造，包括插入、敲除基因等操作，使其序列發(fā)生變化。基因編輯和電腦上編輯一份文檔類(lèi)似，只不過(guò)，其操作對(duì)象是直接影響生物體特質(zhì)的終極密碼——DNA。通常，基因編輯分為剪開(kāi)與修復(fù)兩個(gè)步驟。因此，要想進(jìn)行基因編輯，首先要有把好“剪刀”。

目前，科學(xué)家們用得最順手的基因剪刀就是CRISPR/Cas9，其開(kāi)發(fā)者是美國(guó)麻省理工學(xué)院華裔科學(xué)家張鋒和加州大學(xué)伯克利分校教授詹妮弗·杜德娜等。實(shí)際上，CRISPR/Cas9最初是細(xì)菌抵御外敵的防御系統(tǒng)：當(dāng)有病毒或外來(lái)DNA首次入侵時(shí)，CRISPR/Cas9就會(huì)剪切一段帶有入侵者身份特質(zhì)的DNA（核糖核酸），將其記錄在案，等外敵再次來(lái)犯時(shí)，CRISPR/Cas9會(huì)依據(jù)之前記錄的DNA信息，轉(zhuǎn)錄出一段起著向?qū)ё饔玫腞NA，指引自己對(duì)來(lái)敵精準(zhǔn)識(shí)別，準(zhǔn)確打擊。就是這樣一套系統(tǒng)，被科學(xué)家們用作基因編輯的工具。

但CRISPR/Cas9也有缺點(diǎn)：其剪切點(diǎn)一定要位于一段處于特定位置、名為PAM序列的上游，這意味著CRISPR/Cas9的工作范圍并不能無(wú)死角、全覆蓋。而引導(dǎo)其剪切的RNA還有著容易變身的特點(diǎn)，這同樣會(huì)影響到剪切的準(zhǔn)確度。因此，研發(fā)更可靠、更準(zhǔn)確的新剪刀成了科學(xué)家們的目標(biāo)。這一背景下，名為Argonaute（簡(jiǎn)稱(chēng)Ago）的蛋白家族開(kāi)始相繼登場(chǎng)。

與CRISPR/Cas9相似，Ago蛋白同樣是生物體的防御系統(tǒng)。最初，人們發(fā)現(xiàn)，真核生物體內(nèi)的Ago蛋白能降解外來(lái)的RNA，進(jìn)而又發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于原核生物的Ago蛋白可以消滅入侵的DNA。從形態(tài)上來(lái)說(shuō)，原核與真核生物的區(qū)別在于細(xì)胞核有沒(méi)有核膜，原核生物是指一類(lèi)細(xì)胞核無(wú)核膜包裹的原始單細(xì)胞生物，真核生物則涵蓋了包括人類(lèi)在內(nèi)的所有動(dòng)植物等生命體。

2014年，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)教授約翰·范德歐斯特在原核生物的Ago蛋白家族中，發(fā)現(xiàn)一種名為T(mén)tAgo的蛋白能與具有向?qū)ё饔玫腄NA結(jié)合，在65°C條件下，切割目的DNA。但顯然，高溫限制了其發(fā)揮更大作用的潛力。

業(yè)界一度認(rèn)為，韓春雨的研究突破性地解決了這一弊端。通過(guò)對(duì)比篩選，他發(fā)現(xiàn)另一種來(lái)源于格氏嗜鹽堿桿菌的Ago蛋白，并將其命名為NgAgo。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種蛋白能在37°C常溫下，結(jié)合向?qū)NA，實(shí)現(xiàn)基因編輯。這意味著NgAgo在人類(lèi)疾病治療、生物制藥等領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。而相比CRISPR/Cas9，NgAgo還有著不特定依賴(lài)于PAM序列、以DNA 為向?qū)Р灰资Ш兔摪?、容錯(cuò)率低、效率高等一系列優(yōu)點(diǎn)。

2016年5月8日，新媒體平臺(tái)“知識(shí)分子”，以《韓春雨：“一鳴驚人”的中國(guó)科學(xué)家發(fā)明世界一流新技術(shù)》為題，報(bào)道了韓春雨其人與他的研究。“知識(shí)分子”在這篇注明為“特稿”的文章前加了一段編者按，其中寫(xiě)道：“令國(guó)人激動(dòng)的是，韓春雨在河北科技大學(xué)條件不好、經(jīng)費(fèi)缺乏、人員很少的情況下做出的研究，優(yōu)于世界一流的麻省理工、哈佛、斯坦福?！吨R(shí)分子》主編、北京大學(xué)教授饒毅將韓春雨推介給編輯部，在此我們特別刊出專(zhuān)訪，以饗讀者。”

此后，國(guó)內(nèi)媒體蜂擁而上，對(duì)韓春雨的研究成果進(jìn)行報(bào)道。韓春雨先后被評(píng)為河北省科協(xié)副主席、河北省最美教師、國(guó)家“中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才”候選人、“長(zhǎng)江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”候選人、2016年度高校享受政府特殊津貼人員等。2016年8月，河北省發(fā)改委還批復(fù)并“原則同意”了估算總額達(dá)2.24億元的河北科技大學(xué)基因編輯技術(shù)研究中心的工程建設(shè)項(xiàng)目。

質(zhì)疑聲與贊譽(yù)幾乎同時(shí)而至。在其論文發(fā)表后不到20天，現(xiàn)任美國(guó)普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系教授、當(dāng)時(shí)在清華大學(xué)任教的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家顏寧在微博上首次提出韓春雨論文結(jié)果的可重復(fù)性存在問(wèn)題。

此后，類(lèi)似質(zhì)疑在未名空間、知乎、百度貼吧等論壇上出現(xiàn)。至2016年9月，饒毅與中科院院士邵峰聯(lián)名致信河北科技大學(xué)校長(zhǎng)，稱(chēng)“宜謹(jǐn)慎對(duì)待韓春雨及其研究成果”，并建議成立專(zhuān)家委員會(huì)，核實(shí)韓春雨研究成果。當(dāng)年10月，北大生科院教授魏文勝等13名國(guó)內(nèi)生物學(xué)家聯(lián)名在媒體上公開(kāi)發(fā)聲，表示無(wú)法重復(fù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，希望韓春雨公開(kāi)所有原始數(shù)據(jù)，呼吁學(xué)校及相關(guān)方介入調(diào)查。

2016年11月，《自然·生物技術(shù)》編輯部表示，正在調(diào)查該論文。之后，韓春雨給《自然·生物技術(shù)》編輯部補(bǔ)充了相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2017年1月，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局撤回了韓春雨團(tuán)隊(duì)以Ago為核心的基因編輯技術(shù)專(zhuān)利。據(jù)介紹，目前，該團(tuán)隊(duì)以國(guó)際專(zhuān)利形式重新提交申請(qǐng)，并處于公開(kāi)狀態(tài)。同年8月，由于一直沒(méi)有重復(fù)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，韓春雨團(tuán)隊(duì)撤回論文。《自然·生物技術(shù)》編輯部發(fā)表了《是該數(shù)據(jù)說(shuō)話的時(shí)候了》的社論稱(chēng)，“我們現(xiàn)在確信韓春雨的撤稿決定是維護(hù)已發(fā)表科研記錄完整性的最好做法?！?/p>

之后，韓春雨團(tuán)隊(duì)繼續(xù)尋找論文結(jié)果不能重復(fù)的原因。時(shí)隔一年后，河北科技大學(xué)發(fā)文稱(chēng)，韓春雨團(tuán)隊(duì)不存在主觀造假。但依據(jù)有關(guān)規(guī)定，取消韓春雨所獲得的榮譽(yù)稱(chēng)號(hào)，終止韓春雨團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的科研項(xiàng)目并收回科研經(jīng)費(fèi)。韓春雨團(tuán)隊(duì)回應(yīng)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在缺陷、研究過(guò)程存在著不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯?wèn)題。

兩項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)與基因剪刀的未來(lái)

雖然“韓春雨事件”告一段落，但由他首先提出的NgAgo能否作為基因編輯工具仍無(wú)定論。

早在2016年11月，南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副教授劉東與復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員王永明在《自然》雜志子刊《細(xì)胞研究》上發(fā)表了國(guó)內(nèi)第二篇關(guān)于NgAgo的文章。文章稱(chēng)，用NgAgo可以“敲低”斑馬魚(yú)基因，導(dǎo)致其眼部發(fā)育缺陷。但由于“敲低”只是使基因表達(dá)降低，并沒(méi)有改變基因序列，因此，談不上“編輯”。而由于研究對(duì)象不同，劉東等人稱(chēng)，其研究也“不能對(duì)此前韓春雨的結(jié)論證實(shí)或證偽”。

相比之下，最近發(fā)表的兩項(xiàng)關(guān)于NgAgo的新研究似乎帶給人們更多希望。

在美國(guó)普渡大學(xué)的研究中，NgAgo首先被證實(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中具有切割DNA的能力。更進(jìn)一步，研究人員發(fā)現(xiàn)，NgAgo上兩個(gè)名為PIWI和RepA的部位都能獨(dú)立切割DNA。但與韓春雨結(jié)論不同的是，在普渡大學(xué)開(kāi)展的體外實(shí)驗(yàn)中，NgAgo切割時(shí)，并沒(méi)有和本該配對(duì)的向?qū)NA結(jié)合。負(fù)責(zé)這項(xiàng)研究的普渡大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程助理教授凱文·所羅門(mén)在接受《中國(guó)新聞周刊》采訪時(shí)推測(cè)說(shuō)，這有可能是NgAgo事先已結(jié)合了DNA在復(fù)制過(guò)程產(chǎn)生的其他碎片DNA片段，充當(dāng)向?qū)А?/p>

而在大腸桿菌的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，NgAgo被證明能結(jié)合向?qū)NA，并依靠其切割能力，提升大腸桿菌同源重組的效率。今年1月，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究同樣證明：在巴氏桿菌和大腸桿菌體內(nèi)，NgAgo能提升基因同源重組的效率。但與普渡大學(xué)和韓春雨的研究不同，該論文作者華中農(nóng)大動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授張安定、金梅林等人觀察到，NgAgo對(duì)同源重組的促進(jìn)，是通過(guò)NgAgo的PIWI部位與一種助力同源重組的酶RecA的相互作用?！爱?dāng)然，我們不排除它兩種原理都在起作用?！睆埌捕ㄔ诮邮堋吨袊?guó)新聞周刊》采訪時(shí)說(shuō)。

但需要注意的是，無(wú)論是華中農(nóng)大還是普渡大學(xué)的研究，目前都聚焦的是NgAgo在原核生物中的切割作用。“我們并沒(méi)有打算重復(fù)韓春雨論文中的研究結(jié)論，也就是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯?！彼_門(mén)說(shuō)，“現(xiàn)在說(shuō)NgAgo能否適用于人類(lèi)細(xì)胞基因編輯為時(shí)尚早，我們能夠說(shuō)的是，這是又一個(gè)能提升細(xì)菌中基因編輯的工具，對(duì)生物燃料的生產(chǎn)、制藥等方面能發(fā)揮作用。”

事實(shí)上，在韓春雨論文結(jié)果發(fā)表之初，國(guó)內(nèi)也曾一度掀起跟風(fēng)研究熱潮。據(jù)某不愿具名的業(yè)內(nèi)人士稱(chēng)，國(guó)內(nèi)六七家在這一領(lǐng)域較有實(shí)力的科研機(jī)構(gòu)此前都對(duì)NgAgo很感興趣。但在韓春雨論文被熱烈追捧又遭到強(qiáng)烈質(zhì)疑后，這些研究者又逐漸退出，基本不再涉足該研究領(lǐng)域。相比之下，在世界范圍內(nèi)，對(duì)于NgAgo乃至更大范圍的Ago蛋白家族的研究，仍進(jìn)展不斷。

今年2月，加州理工學(xué)院生物工程系教授阿列克謝·阿拉溫在bioRxiv上發(fā)表論文稱(chēng)，源于丁酸梭菌的CbAgo具有高活性，可用于在中等溫度下切割單鏈和雙鏈DNA。阿拉溫進(jìn)一步表示，在37℃條件下，CbAgo可能在真核細(xì)胞中具有活性。前文提到的荷蘭瓦赫寧根大學(xué)教授范德歐斯特近期也在bioRxiv發(fā)表了類(lèi)似的研究成果。不過(guò)，他對(duì)《中國(guó)新聞周刊》回復(fù)稱(chēng)，“迄今為止，我們還沒(méi)有用CbAgo進(jìn)行人類(lèi)細(xì)胞基因組的編輯，如果應(yīng)用，還需要更多的優(yōu)化”。

國(guó)內(nèi)某權(quán)威科研院所一名長(zhǎng)期研究Ago蛋白家族的研究人員稱(chēng)，當(dāng)初，韓春雨的研究只是該領(lǐng)域眾多科研成果中的一項(xiàng)，即使文章結(jié)論成立，也并無(wú)特別值得關(guān)注之處。他的研究之所以引發(fā)轟動(dòng)效應(yīng)，主要是媒體的炒作。在她看來(lái)，眼下，Ago蛋白用作基因編輯工具還不太合適，“就像拿一把非常鈍的刀子去切肉一樣”，“但不排除以后大家想到什么樣的辦法對(duì)蛋白進(jìn)行一個(gè)非常大的改造，或者兩三個(gè)蛋白一起作用，研究人員應(yīng)該想一些更加有用的辦法。一旦基礎(chǔ)研究有了突破，應(yīng)用上的突破也會(huì)很快跟上。那么究竟突破在哪里？我覺(jué)得還得給大家更多時(shí)間。”

前述不愿具名的業(yè)內(nèi)人士則表示，從目前國(guó)內(nèi)外最新的研究成果來(lái)看，NgAgo有其科研價(jià)值，“顯現(xiàn)出來(lái)很多的效果都是值得我們?nèi)パ芯康摹?。他認(rèn)為，相較國(guó)外的持續(xù)跟進(jìn)，如果國(guó)內(nèi)因?yàn)轫n春雨當(dāng)年被“捧殺”而不再關(guān)注這一研究，將在這一領(lǐng)域處于落后被動(dòng)的地位。