杜娜，戴紅良，賈桂枝

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科二病區(qū)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學 護理學院，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學 生理學教研室，遼寧 錦州 121001）

心肌營養(yǎng)因子-1（cardiotrophin-1,CT-1）屬白細胞介素6 家族成員，最初從小鼠心臟胚胎干細胞中發(fā)現(xiàn)，在體外具有促進心肌細胞肥厚的生物活性[1]。研究顯示心肌細胞在缺氧條件可誘導CT-1的過表達[2]。但目前對于CT-1 的功能及其表達上調(diào)的病理生理機制尚不明確。鑒于氧化應(yīng)激在各種心血管疾病中所起的重要作用，本研究擬探討在氧化應(yīng)激情況下心肌細胞CT-1 的表達情況及其對心肌細胞凋亡的影響，以及氧化應(yīng)激誘導CT-1 表達的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

H9C2 心肌細胞（中國科學院上海細胞庫），胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、過氧化氫、PD98059（美國Sigma 公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美國 Gibco 公司），CT-1 抗體（美國Abcam 公司），Cleaved-Caspase-3、ERK、pERK 抗 體（美 國Cell Signaling 公 司），Annexin V-PI 凋亡試劑盒（北京寶賽生物有 限公司），CT-1 siRNA 干擾序列5'-CCAAUUGCUGGAGG AAUAUTT-3'（蘇州吉瑪基因股份有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置熒光顯微鏡（德國LEICA），流式細胞儀（美國BD公司），電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 檢測方法與指標

1.2.1 Western blotting 檢測 根據(jù)研究目的，將細胞分為不同組別：為檢測過氧化氫對H9C2 細胞CT-1表達及ERK 活化的影響，將細胞分為對照組及不同濃度（50、100、200 μmol/L）過氧化氫組；為檢測抗氧化劑對H9C2 細胞CT-1 表達及Caspase-3 活化的影響，將細胞分為對照組、200 μmol/L 過氧化氫組、N- 乙酰半胱氨酸組、N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組；為檢測CT-1 對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響，將細胞分為對照組、200 μmol/L 過氧化氫組、CT-1 siRNA+過氧化氫組；為檢測ERK 活化對CT-1 表達的影響，將細胞分為對照組、200 μmol/L 過氧化氫組、PD98059 組、PD98059+過氧化氫組。用細胞裂解液收集刺激完成細胞的總蛋白，離心收集上清后測定蛋白濃度，總蛋白行10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用1% BSA 封閉1 h，接著加入待檢測蛋白的一抗4℃孵育過夜。TBST 充分洗膜后，以辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育2 h。TBST 洗膜后，增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence,ECL）顯色，以GAPDH 做為內(nèi)參。

1.2.2 RNA 干擾 H9C2 細胞于轉(zhuǎn)染前一天以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。預先將小干擾RNA（siRNA）與Opti-MEMI 按1 ∶16 混合；陽離子脂質(zhì)體與Opti-MEMI 按照4 ∶11 混合。最后將上述2 個混合體系合并后與4 倍量的DMEM 一起加入到細胞中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。最后，調(diào)整培養(yǎng)體系血清濃度為10%后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)研究。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞 為檢測活性氧類（reactive oxygen species,ROS）及CT-1 對 過 氧 化氫誘導H9C2 細胞凋亡的影響，將細胞分為對照組、200 μmol/L 過氧化氫組、N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組及CT-1 siRNA+過氧化氫組。過氧化氫刺激24 h 后，各組細胞用0.25%胰酶消化2 ～3 min 后，以1 000 r/min 離心5 min 收集細胞，用預冷PBS 洗2 次，加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶各5 μl，避光室溫反應(yīng)15 min，于1 h 內(nèi)利用流式細胞儀檢測細胞凋亡 情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫對H9C2 細胞CT-1 表達的影響

與對照組比較，不同濃度過氧化氫刺激H9C2 細胞24 h 后，Western blotting 檢測結(jié)果顯示CT-1 的表達隨著過氧化氫濃度的增加而增加（見表1和圖1），說明氧化應(yīng)激刺激可增加H9C2 細胞CT-1 的表達。

表1 各組H9C2 細胞CT-1 表達水平比較 （±s）

表1 各組H9C2 細胞CT-1 表達水平比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與50 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05；3）與100 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對表達水平對照組 1.000±0.000 50 μmol/L 過氧化氫組 1.230±0.087 100 μmol/L 過氧化氫組 1.603±0.1811）2）200 μmol/L 過氧化氫組 2.104±0.2261）2）3）F 值 30.655 P 值 0.000

圖1 各組H9C2 細胞CT-1 的表達

2.2 N-乙酰半胱氨酸對H9C2 細胞CT-1 表達的影響

經(jīng)200 μmol/L 過氧化氫刺激后，H9C2 細胞CT-1的表達明顯增強，而抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸預處理可顯著抑制過氧化氫誘導的CT-1 的表達（見表2和圖2），表明過氧化氫誘導CT-1 的過表達是通過ROS 介導的。

表2 各組N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導的 CT-1 表達影響 （n =3，±s）

表2 各組N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導的 CT-1 表達影響 （n =3，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對表達水平對照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.155±0.2531）N-乙酰半胱氨酸組 1.033±0.125 N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 1.117±0.1822）F 值 32.656 P 值 0.000

圖2 N-乙酰半胱氨酸抑制過氧化氫誘導CT-1 的表達

2.3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 干擾對H9C2 細胞凋亡的影響

經(jīng)200 μmol/L 過氧化氫刺激后，流式細胞儀檢測顯示H9C2 細胞的凋亡明顯增加，而N-乙酰半胱氨酸預處理則明顯抑制過氧化氫引起的細胞凋亡；相反，CT-1 敲低后H9C2 細胞的凋亡更加嚴重。見表3和圖3。

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對過氧化氫誘導 H9C2 細胞凋亡的影響 （±s）

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對過氧化氫誘導 H9C2 細胞凋亡的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 凋亡率/%對照組 5.841±1.145 200 μmol/L 過氧化氫組 22.174±3.1721）N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 10.351±1.3392）CT-1 siRNA+過氧化氫組 27.297±2.1442）F 值 67.600 P 值 0.000

圖3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對過氧化氫 誘導H9C2 細胞凋亡的影響

2.4 N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導Caspase-3活化的影響

Active Caspase-3 的表達表明過氧化氫可通過對CT-1 的過表達負反饋性地抑制H9C2 細胞的凋亡。見表4、圖4和表5、圖5。

2.5 PD98059 對過氧化氫誘導的CT-1 表達的影響

與對照組比較，過氧化氫可濃度依賴性地促進H9C2 細胞ERK 的活化（見表6和圖6），而絲裂原活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）特異性抑制劑PD98059 可顯著抑制過氧化氫誘導的CT-1 表達上調(diào)（見表7和圖7）。

表4 N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響 （±s）

表4 N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 Active Caspase-3 相對表達水平對照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.154±0.1941）N-乙酰半胱氨酸組 0.964±0.148 N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 0.952±0.2082）F 值 40.721 P 值 0.000

圖4 N-乙酰半胱氨酸對過氧化氫誘導 Caspase-3 活化的影響

表5 CT-1 siRNA 對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響 （±s）

表5 CT-1 siRNA 對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 Active Caspase-3 相對表達水平對照組 1.000 ± 0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 1.846 ± 0.1571）CT-1 siRNA+過氧化氫組 2.591 ± 0.2432）F 值 68.059 P 值 0.000

圖5 CT-1 siRNA 對過氧化氫誘導Caspase-3 活化的影響

3 討論

成年心肌細胞屬終端分化細胞，不具有再生增殖的能力。因此，心肌細胞的存活在維持心臟的功能和發(fā)育中起著極為關(guān)鍵的作用。當遇到各種傷害性刺激時，心肌細胞會通過自分泌或旁分泌等形式釋放細胞保護因子，作為負反饋機制對抗各種損傷。

表6 過氧化氫對ERK 活化的影響 （±s）

表6 過氧化氫對ERK 活化的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與50 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 pERK/ERK 相對水平對照組 1.000±0.000過氧化氫 50 μmol/L 組 1.646±0.2141）過氧化氫 100 μmol/L 組 1.982±0.2291）2）過氧化氫 200 μmol/L 組 1.818±0.1361）F 值 19.001 P 值 0.001

圖6 過氧化氫對ERK 活化的影響

表7 PD98059 對過氧化氫誘導CT-1 表達的影響 （±s）

表7 PD98059 對過氧化氫誘導CT-1 表達的影響 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對表達水平對照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.042±0.1771）PD98059 組 1.067±0.125 PD98059+過氧化氫組 1.205±0.1652）F 值 37.923 P 值 0.000

圖7 PD98059 對過氧化氫誘導CT-1 表達的影響

CT-1 在血清剝奪[3]、熱休克[4]、缺血再灌注損傷等[5]損傷中呈現(xiàn)心肌保護的特性。體外研究顯示[5]，在低氧狀態(tài)下，心肌細胞CT-1 表達增加；體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定性心絞痛[6]、急性心肌梗死[7]、高血壓性心臟病等[8]病理狀態(tài)下，外周循環(huán)中的CT-1 水平是增加的。但對于CT-1 在上述病理條件下如何升高，及其在疾病過程中發(fā)揮何種作用，目前尚不完全明確。

在缺血缺氧狀態(tài)下，心肌組織會產(chǎn)生過量的ROS。這些ROS 攻擊細胞的脂質(zhì)、DNA 及蛋白質(zhì)等生物大分子，并誘導心肌細胞發(fā)生凋亡[9-10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可顯著抑制過氧化氫誘導的H9C2 心肌細胞活化Caspase-3 的表達及凋亡。既然缺血缺氧可以誘導CT-1 的過表達，就有理由推測ROS 增加有可能是誘導CT-1 過表達的的重要機制。本研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫可劑量依賴性地誘導CT-1 的過表達。而且，利用特異性siRNA 敲低CT-1 后，無論是活化Caspase-3 的表達還是細胞的凋亡率均較過氧化氫組顯著增加，表明上述病理狀態(tài)下由ROS 激發(fā)的CT-1 過表達起到一種負反饋性保護機制，起到對抗氧化性損傷本身所帶來的細胞損傷的作用。這與DONG 等[11]報道的CT-1 處理能促進心肌細胞活力的結(jié)論相一致。

本研究進一步對過氧化氫誘導CT-1 表達的機制進行初步探討。有研究顯示，過氧化氫預處理能通過激活ERK 保護心肌細胞對抗氧化應(yīng)激引起的損傷和凋亡[12]。筆者推測過氧化氫誘導的CT-1 過表達有可能與ERK 的活化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK 特異性抑制劑PD98059 能顯著抑制過氧化氫誘導的CT-1過表達。由此可見，ERK 不光可以作為下游分子介導CT-1 的各種生物學活性[13]，本研究也是首次發(fā)現(xiàn)ERK 可以作為上游分子介導CT-1 的過表達。對ERK如何能促進CT-1 的表達有待于進一步研究。

綜上所述，本研究證實氧化應(yīng)激在誘導心肌細胞發(fā)生凋亡性損傷的同時，可通過激活ERK 反饋性地誘導CT-1 的過表達，從而限制由氧化應(yīng)激本身帶來的心肌細胞損害。本研究不僅有助于進一步理解心血管疾病的病理生理機制，也可為疾病的防治提供新的線索。