雷鎮(zhèn)歐，陳水科，李想*

(1.四川旅游學(xué)院，成都 610100；2.嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

牛肝菌是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的統(tǒng)稱，目前確認(rèn)的品種有153種，富含多糖、多酚等多種活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、保護(hù)肝損傷等保健功效，又因其氨基酸含量豐富，味道鮮美，廣受消費(fèi)者歡迎[1]；目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)人工栽培，加工成鮮食品、干制品、休閑食品、菌醬等產(chǎn)品[2]。因其富含呈味物質(zhì)，其發(fā)酵調(diào)味醬被廣泛使用，發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性變化直接影響成品醬的風(fēng)味，成為調(diào)味品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

本文采用市售鮮白牛肝菌為原料，將其添加到豆瓣醬的加工過(guò)程中，正交試驗(yàn)優(yōu)化其配方，對(duì)比不同發(fā)酵溫度條件，分析牛肝菌豆瓣醬的還原糖含量、氨基酸態(tài)氮含量、總酸含量、蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖化酶活性等理化指標(biāo)的變化規(guī)律，研究不同發(fā)酵模式下溫度對(duì)牛肝菌豆瓣醬風(fēng)味的影響，探索其發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)量變化規(guī)律，為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的改良提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料

鮮白牛肝菌、胡豆、面粉、食鹽：購(gòu)于成都市龍泉驛區(qū)農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 設(shè)備

VM0198破壁料理機(jī)：Vita-Mix公司；GL2201-1SCN電子天平：上海雙旭電子有限公司；PV顯微分光光度計(jì)：北京美嘉圖科技有限公司；A330333臺(tái)式酸度計(jì)、DZX320生化培養(yǎng)箱：上海艾測(cè)電子科技有限公司；其他烹飪加工器皿：均由四川旅游學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)配方及制備工藝參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)預(yù)制實(shí)驗(yàn)確定，分別采用恒溫模式、先高溫后低溫模式、先低溫后高溫模式3種發(fā)酵溫度模式進(jìn)行發(fā)酵[4]。將牛肝菌豆瓣醬分成3個(gè)組別，每組3個(gè)平行組，分別在第0，5，10，15，20，25，30天7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)。

1.2.2 牛肝菌豆瓣醬制備工藝

1.2.2.1 原料初步處理

種曲的制備參照劉永琪的方法[5]；蠶豆曲的制備參照丁祖志[6]關(guān)于蠶豆曲的制備工藝；牛肝菌的處理：將鮮白牛肝菌用多功能料理機(jī)制茸備用。

1.2.2.2 工藝流程

將蠶豆曲1000 g、鮮白牛肝菌茸100 g、種曲20 g、鹽80 g、水300 g混合均勻放入密封容器內(nèi)自然發(fā)酵，用水隔絕空氣，每3天攪拌1次，發(fā)酵周期為30天。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度

分別采用恒溫模式：35 ℃發(fā)酵30天、先高溫后低溫模式：50 ℃ 10天→40 ℃10天→30 ℃10天、先低溫后高溫模式：30 ℃10天→40 ℃10天→50 ℃10天3種發(fā)酵模式進(jìn)行發(fā)酵，分別用模式1、模式2、模式3標(biāo)注。

1.2.3 主要化學(xué)成分檢測(cè)

總酸的測(cè)定采用酸堿滴定法，具體操作參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)[7]；

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定采用酸度計(jì)法，具體操作參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)[8]；

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用分光光度法，具體操作參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)[9]；

還原糖含量的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，具體操作參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 主要酶活性檢測(cè)

蛋白酶活力的測(cè)定采用甲醛法，具體操作參照SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》標(biāo)準(zhǔn)；淀粉酶活力的測(cè)定采用比色法，具體操作參照GB/T 5521-2008《糧油檢驗(yàn) 谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)組別試驗(yàn)重復(fù)3次，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和均值差異性分析，P<0.05。

2 結(jié)果分析

2.1 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬總酸含量的影響

總酸含量是評(píng)價(jià)發(fā)酵醬料衛(wèi)生的主要指標(biāo)，其含量多少直接顯示其發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸微生物的數(shù)量以及是否被雜菌污染等，總酸含量過(guò)高引起菌落數(shù)量失衡，導(dǎo)致出品質(zhì)量不合格[11]。由圖1可知，模式1和模式3總酸增加幅度在0～10天內(nèi)較快，10～30天增加平緩；模式2在0～15天增加平緩，15～20天增加幅度加大，20～30天增加幅度平緩。分析發(fā)現(xiàn)模式1和模式3在0～10天內(nèi)溫度適宜，產(chǎn)酸微生物大量繁殖，酸類物質(zhì)增加較多，模式2在15～20天時(shí)溫度較適宜。30天時(shí)模式3總酸含量高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其適宜的溫度繁殖了不同的菌群，其受食鹽添加量的影響，本配方食鹽添加量不能有效抑制其他產(chǎn)酸菌群的繁殖；食鹽用量過(guò)多會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，影響發(fā)酵效果；綜上，模式3要通過(guò)調(diào)節(jié)配方食鹽含量干預(yù)產(chǎn)酸菌群，優(yōu)化發(fā)酵效果。

圖1 牛肝菌豆瓣醬總酸含量變化Fig.1 The change of total acids content inBoletus edulis broad bean paste

2.2 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬氨基酸態(tài)氮含量的影響

圖2 牛肝菌豆瓣醬氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.2 The change of amino acid nitrogen content inBoletus edulis broad bean paste

由圖2可知，3種發(fā)酵溫度環(huán)境下，氨基酸態(tài)氮含量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，主要是牛肝菌、豆瓣中蛋白質(zhì)大分子被發(fā)酵前期的蛋白酶降解，其降解程度受發(fā)酵溫度影響。3種模式溫度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，模式1、模式3前期降解程度強(qiáng)于模式2，主要是其溫度適宜，模式2溫度過(guò)高不利于降解反應(yīng)，模式1和模式3在0～20天氨基酸態(tài)氮含量始終增加，而模式2在15天已經(jīng)達(dá)到最高值；隨著時(shí)間增加，相關(guān)酶活性降低，蛋白質(zhì)分解停止，在氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值后開始被呈味物質(zhì)消耗，其含量慢慢下降，說(shuō)明模式2發(fā)酵速度和風(fēng)味物質(zhì)形成時(shí)間早于模式1和模式3。從氨基酸態(tài)氮含量變化角度分析，模式3的先低溫后高溫模式優(yōu)于模式1的恒溫模式，優(yōu)于模式2的先高溫后低溫模式。

2.3 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬蛋白質(zhì)含量的影響

圖3 牛肝菌豆瓣醬蛋白質(zhì)含量變化Fig.3 The change of protein content in Boletus edulis broad bean paste

牛肝菌豆瓣醬中的蛋白質(zhì)主要來(lái)源于牛肝菌和豆瓣中，其被微生物分解成多肽和游離氨基酸，是醬料風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源。由圖3可知，在3種模式溫度下，牛肝菌豆瓣醬蛋白質(zhì)含量變化幅度相對(duì)穩(wěn)定，模式2在10～20天蛋白質(zhì)含量增幅相對(duì)較大，可能是受微生物分解減慢引起的；最終測(cè)定蛋白質(zhì)含量較初始測(cè)定增加，主要是揮發(fā)性物質(zhì)酶解過(guò)程中速度緩慢，對(duì)氮需求量減少以及水分揮發(fā)引起的。

2.4 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬還原糖含量的影響

牛肝菌豆瓣醬原料中的淀粉被水解成還原糖，是微生物的主要能源物質(zhì)，其含量變化直接反映出醬料微生物的繁殖情況以及淀粉的水解程度[12]。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，還原糖被酵母菌等發(fā)酵成有機(jī)酸和醇類物質(zhì)，直接影響后期風(fēng)味物質(zhì)的形成。還原糖與氨基酸發(fā)生氨基美拉德反應(yīng)，影響醬料發(fā)酵色澤。還原糖是衡量醬料風(fēng)味物質(zhì)含量、色澤形成的重要指標(biāo)。

圖4 牛肝菌豆瓣醬還原糖含量變化Fig.4 The change of reducing sugar content inBoletus edulis broad bean paste

由圖4可知，3種不同發(fā)酵溫度模式下牛肝菌豆瓣醬中的還原糖含量均呈上升趨勢(shì)，主要是發(fā)酵過(guò)程中還原糖的生產(chǎn)量高于其消耗量，比較3種模式，模式1與模式3前期還原糖含量的積累量高于模式2，主要是模式2前期發(fā)酵溫度過(guò)高，雖有利于糖化酶的還原，但是相對(duì)高溫使淀粉酶的穩(wěn)定性降低，活性降低。模式1和模式3在20天時(shí)開始下降，主要是受酶活力的影響，還原糖化酶的速度降低，模式2在20天時(shí)仍保持增長(zhǎng)，主要是其后期發(fā)酵溫度適宜淀粉酶的穩(wěn)定，但從還原糖含量總量來(lái)看，模式1和模式3優(yōu)于模式2，更有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成和形成良好的發(fā)酵色澤。

2.5 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬蛋白酶活性變化的影響

圖5 牛肝菌豆瓣醬蛋白酶活性變化Fig.5 The change of protease activity of Boletus edulis broad bean paste

蛋白酶活性主要受pH值、鹽濃度等的影響，隨著發(fā)酵過(guò)程中酸度的增加，其活性下降。由圖5可知，對(duì)比3種溫度模式，模式1和模式3蛋白酶活性下降較為平緩，模式2蛋白酶活性下降較快，主要是受溫度和發(fā)酵醬中酸度的影響，這與前面分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)，驗(yàn)證了牛肝菌豆瓣醬總酸含量的變化趨勢(shì)。綜合分析，模式2先高溫后低溫模式相對(duì)較差。

2.6 不同發(fā)酵溫度模式對(duì)牛肝菌豆瓣醬淀粉酶活性變化的影響

圖6 牛肝菌豆瓣醬淀粉酶活性變化Fig.6 The change of amylase activity of Boletus edulis broad bean paste

牛肝菌豆瓣醬中豆瓣是淀粉的主要來(lái)源，其在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)過(guò)淀粉酶的作用水解，加速后期微生物的產(chǎn)酸、產(chǎn)醇類物質(zhì)，直接影響牛肝菌豆瓣醬風(fēng)味物質(zhì)的形成和色澤。由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，淀粉酶活性呈下降趨勢(shì)，主要是發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，微生物總量減少，淀粉酶產(chǎn)生的數(shù)量隨之減少，其活性降低，另外在發(fā)酵過(guò)程中，水分蒸發(fā)以及pH值降低，抑制淀粉酶活性。模式2先高溫后低溫模式下降幅度明顯高于模式1和模式3，主要是在相對(duì)溫度較高的環(huán)境下，淀粉酶穩(wěn)定性下降，影響還原糖的生成和發(fā)酵質(zhì)量?；诖?，模式2先高溫后低溫模式淀粉酶活性略低于模式1和模式3。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別采用恒溫模式、先高溫后低溫模式、先低溫后高溫模式3種發(fā)酵溫度模式進(jìn)行發(fā)酵，分析不同發(fā)酵模式下牛肝菌豆瓣醬中總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量、蛋白質(zhì)含量、還原糖含量的變化，通過(guò)鹽的添加控制總酸的量的前提下，模式2先高溫后低溫發(fā)酵模式劣于模式1恒溫模式與模式3先低溫后高溫模式；進(jìn)一步比較3種發(fā)酵溫度模式的蛋白酶活性、淀粉酶活性的變化情況，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期相對(duì)高溫發(fā)酵導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性下降，影響醬料中酶的活性，驗(yàn)證了前期理化檢驗(yàn)結(jié)果的變化情況。最終確定采用先低溫后高溫模式：30 ℃10天→40 ℃10天→50 ℃10天牛肝菌豆瓣醬的發(fā)酵效果最佳。研究不同發(fā)酵模式下溫度對(duì)牛肝菌豆瓣醬風(fēng)味的影響，探索其發(fā)酵過(guò)程中的質(zhì)量變化規(guī)律，為傳統(tǒng)發(fā)酵工藝改良提供了理論依據(jù)。