朱辰，張乃方，徐陳超，張凱杭，程磊

（浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生命系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058）

氮素對(duì)于地球上所有生物而言都不可或缺，它參與形成了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)和核酸的必要組成成分之一。其中，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是自然界中氮元素常見(jiàn)的存在形式。在傳統(tǒng)的氮循環(huán)框架中，固氮細(xì)菌將大氣中的氮?dú)夤潭殇@態(tài)氮，而銨態(tài)氮向氮?dú)獾霓D(zhuǎn)化需要2步反應(yīng)[1-2]：第一步是在有氧條件下，硝化細(xì)菌將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[3]；第二步是在厭氧條件下，由反硝化菌把硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化成氮?dú)鈁4]（圖1）。

20世紀(jì)90年代，對(duì)“厭氧氨氧化”[式（1）]的發(fā)現(xiàn)及相關(guān)微生物的鑒定打破了好氧氨氧化的傳統(tǒng)觀念[5-7]。

迄今為止，無(wú)數(shù)關(guān)于厭氧氨氧化菌的研究揭示了這類細(xì)菌具有廣泛的分布及可能演化出的與眾不同的結(jié)構(gòu)與代謝特征。本文總結(jié)了最為常見(jiàn)的研究方法與技術(shù)，并在群落、細(xì)胞、分子與組學(xué)3個(gè)不同的層面論述了它們?cè)趨捬醢毖趸芯恐衅鸬降耐苿?dòng)作用（圖2）。

圖1 氮循環(huán)框架Fig.1 Framework of nitrogen cycle

圖2 厭氧氨氧化菌研究發(fā)展示意圖Fig.2 Timeline ofANAMMOX bacteria research

1 群落水平

經(jīng)典的培養(yǎng)方法和氮同位素標(biāo)記相結(jié)合，為厭氧氨氧化過(guò)程及相關(guān)微生物的初步了解打下了基礎(chǔ)。

1.1 厭氧氨氧化的發(fā)現(xiàn)

早期的厭氧氨氧化研究主要集中在厭氧生物反應(yīng)器中。1995年，MULDER等[7]證實(shí)了BRODA的猜測(cè)[8]，他們發(fā)現(xiàn)在反硝化流化床反應(yīng)器（denitrifying fluidized-bed reactor,DFBR）中，隨著氮?dú)獾漠a(chǎn)生，銨根離子和硝酸根離子的消耗也在不斷增加，由此他們提出了在厭氧條件下以硝酸根離子（后來(lái)證明是亞硝酸根離子）為電子受體的銨根離子氧化反應(yīng)，并將其命名為“厭氧氨氧化”[7]。緊接著，VAN DE GRAAF等通過(guò)滅菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，厭氧氨氧化實(shí)際上是微生物參與的氧化還原反應(yīng)[5]。

由于厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)極為緩慢，迄今仍未獲得它們的純培養(yǎng)，但一些厭氧生物反應(yīng)器的應(yīng)用使厭氧氨氧化菌的富集研究取得了很大進(jìn)展。首先，序批式反應(yīng)器（sequencing batch reactor,SBR）利用生物膜，不僅提高了生物量的保留，還在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持了反應(yīng)器內(nèi)穩(wěn)定的底物環(huán)境，因此成功將厭氧氨氧化菌在富集后的微生物群落中的比例提升到了80%[9]，為厭氧氨氧化菌的分類鑒定打下了基礎(chǔ)。隨后，膜生物反應(yīng)器（membrane bioreactor,MBR）被證明是更為有效的富集工具，它一方面滿足了厭氧氨氧化菌懸浮的自由生長(zhǎng)狀態(tài)，另一方面減少了細(xì)菌因?yàn)殡y以沉淀而造成的損失。在用MBR獲得的富集產(chǎn)物中，厭氧氨氧化菌的比例可以達(dá)到97.6%[10]，使得其全基因序列獲取成為可能。

1.2 厭氧氨氧化的環(huán)境分布

在厭氧氨氧化發(fā)現(xiàn)之初，厭氧氨氧化的發(fā)生途徑及它在自然界的地位是研究人員十分關(guān)注的問(wèn)題，然而，采用單純測(cè)定反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度的方法無(wú)法提供明確的證據(jù)表征其通量，而同位素標(biāo)記法的出現(xiàn)為厭氧氨氧化的研究帶來(lái)了新的機(jī)遇。

同位素是同一元素的不同原子，它們質(zhì)子數(shù)相同，中子數(shù)不同，但是除了相對(duì)原子質(zhì)量不同以外，化學(xué)性質(zhì)基本相同。研究中，同位素標(biāo)記培養(yǎng)常被用來(lái)追蹤特定元素的轉(zhuǎn)變過(guò)程。1997年，VAN DE GRAAF等首次嘗試在反應(yīng)器的培養(yǎng)體系中添加了15N標(biāo)記的氮化合物，以此分析厭氧氨氧化的代謝通路，并預(yù)測(cè)聯(lián)氨可能作為中間產(chǎn)物[11]。

在自然生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面，同位素標(biāo)記起著十分重要的作用。反硝化產(chǎn)生的氮?dú)庵械牡尤縼?lái)源于硝酸根離子，而厭氧氨氧化產(chǎn)生的氮?dú)庵械牡右粋€(gè)來(lái)自銨根離子，另一個(gè)來(lái)自亞硝酸根離子，因此它們的來(lái)源并不相同。在添加15N標(biāo)記的和或者和對(duì)樣品進(jìn)行厭氧培養(yǎng)后，通過(guò)氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜儀測(cè)定產(chǎn)物氮?dú)庵械?9N2和30N2，可以得知在總的氮?dú)猱a(chǎn)生中厭氧氨氧化所占的比例，從而估算環(huán)境中厭氧氨氧化在氮素流失上作出的貢獻(xiàn)。

借助同位素標(biāo)記，越來(lái)越多的研究驗(yàn)證了厭氧氨氧化在自然生態(tài)系統(tǒng)中的重要地位。例如在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，厭氧氨氧化的貢獻(xiàn)范圍為0～67%[12]，有時(shí)甚至可以超過(guò)反硝化；在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，如天然淡水湖坦噶尼喀湖，厭氧氨氧化所產(chǎn)生的氮?dú)庖部梢赃_(dá)到13%[13]；而在陸地生態(tài)系統(tǒng)如水稻田中，同樣也存在著厭氧氨氧化，其貢獻(xiàn)的比例為4%～37%[14]。

厭氧氨氧化菌的分布差異可能是受到了環(huán)境因子的限制。作為厭氧微生物，厭氧氨氧化菌對(duì)氧氣濃度的變化十分敏感，以空氣中含氧量100%為氧飽和，它們?cè)诘陀?%氧飽和的環(huán)境下可以生存，高于18%氧飽和的氧分壓會(huì)抑制它們的活性[15]；許多研究表明，pH中性或者弱堿性的條件比較適合厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)和反應(yīng)的發(fā)生，例如在反應(yīng)器中的厭氧氨氧化菌，最適pH范圍為6.7～8.3[11,16]；溫度也是厭氧氨氧化反應(yīng)的另一個(gè)重要限制因子，厭氧氨氧化菌最適應(yīng)的溫度范圍是20～43℃[17]。此外，取樣深度[18]、鹽度[19]、有機(jī)質(zhì)濃度[17,20]等也都會(huì)對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)產(chǎn)生影響。

近年來(lái)，陸續(xù)有研究證實(shí)全球氣候變化可以對(duì)全球碳氮循環(huán)帶來(lái)影響[21-23]，而厭氧氨氧化反應(yīng)對(duì)全球氣候變化的響應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

2 細(xì)胞水平

以16S rRNA基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的一系列分子手段的加入推進(jìn)了厭氧氨氧化菌的結(jié)構(gòu)、分類和代謝特征相關(guān)的研究。

2.1 鑒定與分類

1999年，STROUS等首次對(duì)厭氧氨氧化菌使用16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行鑒定和分類，發(fā)現(xiàn)它們是屬于浮霉菌門(mén)的一個(gè)單獨(dú)分支[6]，促使厭氧氨氧化菌的研究深入到細(xì)胞水平。

16S rRNA基因測(cè)序分析一直作為揭示細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)菌鑒定的重要方法之一。rRNA是一段十分理想的研究細(xì)菌分類的基因序列。幾乎所有微生物都需要核糖體來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，編碼核糖體的序列在細(xì)胞中有著很高的比例且不可或缺，而且它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中十分保守，因此常用作細(xì)菌的分類和進(jìn)化判斷的依據(jù)。

迄今為止，已經(jīng)有Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus、Jettenia和Scalindua5個(gè)屬被歸為厭氧氨氧化菌。厭氧氨氧化菌在自然界分布十分廣泛，不僅存在于海洋、淡水、陸地等各種生態(tài)系統(tǒng)中，甚至在極端溫度或者pH的環(huán)境中也有它們的分布（表1）。

在已知的厭氧氨氧化菌里，Brocadia、Kuenenia、Anammoxoglobus和Jettenia4個(gè)屬大多出現(xiàn)在淡水或者人工處理系統(tǒng)中；而在海洋生態(tài)系統(tǒng)中則以Scalindua最為常見(jiàn)，特別是在一些海洋沉積物和最小含氧區(qū)（oxygen minimum zone,OMZ）中；Brocadia和Jettenia在土壤中占據(jù)主導(dǎo)地位。在一些情況下，微生物群落組成還會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，例如在人工濕地系統(tǒng)中，單一的Brocadia在培養(yǎng)之后逐漸變成了由Jettenia、Brocadia和Anammoxoglobus組成的混合菌群[24]。

2.2 原位檢測(cè)

基于堿基互補(bǔ)原則的熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）已經(jīng)逐漸成為微生物生態(tài)學(xué)研究中的有力工具。它先是使用帶有Cy3、Cy5等熒光基團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸探針對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行原位標(biāo)記，再通過(guò)檢測(cè)原位熒光來(lái)顯示特定核苷酸序列（通常選用rRNA基因序列）的存在和分布。FISH操作快速且具有很高的靈敏性。在長(zhǎng)期的摸索中，許多探針以其準(zhǔn)確性和普適性在厭氧氨氧化研究中被廣泛使用（表2）。

表1 厭氧氨氧化菌在不同環(huán)境中的分布Table 1 Distribution ofANAMMOX bacteria in different systems

表2 熒光原位雜交常用探針Table 2 Probes frequently used in fluorescence in situ hybridization(FISH)

FISH不僅在許多自然環(huán)境中原位證明了厭氧氨氧化菌的存在，還可以完成厭氧氨氧化菌的定量分析，例如在黑海和本格拉上升流等海洋水體的研究中，以FISH標(biāo)記為依據(jù)的厭氧氨氧化菌細(xì)胞計(jì)數(shù)表明單細(xì)胞的反應(yīng)速率和之前在反應(yīng)器內(nèi)測(cè)得的數(shù)據(jù)相吻合[29,34]。

然而，在陸地生態(tài)系統(tǒng)的研究中，F(xiàn)ISH面臨著較大的局限性。厭氧氨氧化菌的低豐度及大量可以產(chǎn)生自發(fā)熒光的干擾物對(duì)FISH的靈敏度提出了更高要求。催化報(bào)告沉積熒光原位雜交（catalyzed reporter deposition-fluorescencein situhybriddization,CARD-FISH）技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。它使用以辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的寡核苷酸探針，雜交完成后加入含有熒光標(biāo)記的酪胺，利用HRP催化酪胺沉積的酶促反應(yīng)使得熒光信號(hào)隨之聚集。熒光信號(hào)的放大無(wú)疑可以大幅度增強(qiáng)顯微鏡下標(biāo)記微生物的辨識(shí)度。

2015年，NIE等在水稻田土壤樣品中采用CARD-FISH進(jìn)行原位檢測(cè)，并成功獲得了厭氧氨氧化菌原位圖像[51]。相信隨著這一技術(shù)的不斷成熟和推廣，將會(huì)給陸地生態(tài)系統(tǒng)中厭氧氨氧化的研究帶來(lái)更多的契機(jī)。

2.3 定量分析

在厭氧氨氧化菌研究中，定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR)同樣也是一項(xiàng)與基因測(cè)序相結(jié)合的分子技術(shù)。常被用到的方法包括TaqMan探針?lè)ê蚐YBR Green染料法。qPCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的擴(kuò)增，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光信號(hào)可以根據(jù)外參基因或者內(nèi)參基因所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。

在許多研究中，厭氧氨氧化菌豐度的估算都會(huì)以厭氧氨氧化菌的16S rRNA基因作為目標(biāo)基因[14,36,52]，如HAMERSLEY等發(fā)現(xiàn)在秘魯海洋最小含氧區(qū)的水體中，幾乎所有深度都有厭氧氨氧化菌的分布，而且它們?cè)诳側(cè)后w中所占的比例從0.8%到3.1%不等[36]。除此之外，一些功能基因如聯(lián)氨氧化酶基因（hzo）[53-54]和聯(lián)氨合成酶基因（hzs）[26,41-55]等也會(huì)被用來(lái)進(jìn)行厭氧氨氧化菌的豐度評(píng)估。

2.4 細(xì)胞結(jié)構(gòu)

在引入現(xiàn)代分子手段的同時(shí)，STROUS等借助透射電子顯微鏡找到了富集于微生物群落中的厭氧氨氧化菌，發(fā)現(xiàn)它們外觀呈不規(guī)則的球狀，平均直徑為0.8～1.1 μm[6]。值得注意的是，厭氧氨氧化菌有著一層由致密的“梯烷（ladderane）”組成的膜，這層膜在細(xì)胞內(nèi)部形成了一個(gè)封閉的厭氧氨氧化體（anammoxosome）（圖3），這個(gè)結(jié)構(gòu)在其他已知的原核生物中都沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)。厭氧氨氧化體可以占據(jù)細(xì)胞50%～80%的體積[56]，致密的膜結(jié)構(gòu)有效地防止了厭氧氨氧化反應(yīng)過(guò)程中有毒產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞。正是因?yàn)閰捬醢毖趸Y(jié)構(gòu)上的這一特點(diǎn)，所以在很多研究中，梯烷也可以作為厭氧氨氧化菌的特征性標(biāo)志物，用來(lái)探測(cè)厭氧氨氧化菌在環(huán)境中的分布[13,29,34]。

圖3 厭氧氨氧化菌的結(jié)構(gòu)及厭氧氨氧化代謝途徑Fig.3 Structure and metabolic pathway of ANAMMOX bacteria

3 組學(xué)分析水平

基因組學(xué)（genomics）和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的應(yīng)用使厭氧氨氧化菌的代謝途徑和代謝相關(guān)酶類愈發(fā)清晰。

3.1 基因組學(xué)

在基因組中，通常相同功能或者相同起源的基因會(huì)聚集形成基因簇，而通過(guò)與已知功能基因的相似性比對(duì)來(lái)預(yù)測(cè)基因組中不同位置基因的功能，可以很好地反映這個(gè)物種的代謝需求。2006年，STROUS等從環(huán)境DNA中獲得了CandidatusKuenenia stuttgartiensis(K.stuttgartiensis)相對(duì)完整的基因序列，在厭氧氨氧化菌的代謝和功能研究中加入了基因組學(xué)分析[57]。在K.stuttgartiensis基因組中，有200多個(gè)與厭氧氨氧化有關(guān)的基因。根據(jù)亞硝酸鹽還原酶基因（nirS）的出現(xiàn)，STROUS等提出在厭氧氨氧化反應(yīng)中，可能存在以NO為中間產(chǎn)物的新型代謝途徑[57]。

另外，對(duì)基因組的分析還帶來(lái)了其他的發(fā)現(xiàn)。在結(jié)構(gòu)上，浮霉菌門(mén)細(xì)菌的細(xì)胞壁一直被認(rèn)為不含肽聚糖，但在K.stuttgartiensis中卻檢測(cè)到一些編碼肽聚糖的基因，近年研究也證實(shí)厭氧氨氧化菌的細(xì)胞壁中的確含有少量肽聚糖[58]，這表明厭氧氨氧化菌本該屬于革蘭氏陰性菌。

在固定二氧化碳方面，K.stuttgartiensis存在著編碼完整的乙酰輔酶A途徑的基因。隨著關(guān)鍵酶活性的證實(shí)，說(shuō)明厭氧氨氧化菌其實(shí)是一類通過(guò)乙酰輔酶A途徑進(jìn)行二氧化碳固定的化能自養(yǎng)菌。

新近研究也表明，在銨的吸收方面，K.stuttgartiensis基因編碼的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，有一類只與銨根離子結(jié)合并不參與轉(zhuǎn)運(yùn)的不同于其他家族成員的蛋白，它們很有可能代表了進(jìn)化上比較原始的一類銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[59]。

近年來(lái)，Brocadia、Jettenia和Scalindua的部分或完全基因組序列也相繼被測(cè)出[60-62]。分析表明，不同種類的厭氧氨氧化菌在編碼關(guān)鍵酶的基因上存在一些差異，例如在K.stuttgartiensis和CandidatusScalindua profunda(S.profunda)中存在的nirS，并不存在于CandidatusBrocadia fulgida(B.fulgida)和CandidatusJettenia asiatica(J.asiatica)中，預(yù)示著它們的亞硝酸鹽代謝途徑可能有所不同。

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)

轉(zhuǎn)錄組代表的是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的水平，在轉(zhuǎn)錄水平上的分析往往更能代表細(xì)菌的活性。2011年，KARTAL等利用蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析，闡明了K.stuttgartiensis完整的分子機(jī)制[63]：在厭氧氨氧化體內(nèi)，亞硝酸還原酶首先將亞硝酸根離子還原成一氧化氮；然后，一氧化氮與銨在聯(lián)氨生成酶作用下反應(yīng)生成中間產(chǎn)物聯(lián)氨；最后，聯(lián)氨在聯(lián)氨脫氫酶的作用下分解形成氮?dú)猓瓿烧麄€(gè)厭氧氨氧化循環(huán)（圖2）。

4 展望

厭氧氨氧化不僅在自然界具有重要的地位，在污水處理方面也起著重要的作用[64]。直接氧化銨產(chǎn)生氮?dú)夂?jiǎn)化了硝化-反硝化反應(yīng)過(guò)程，節(jié)省了物質(zhì)和能源的消耗。目前已經(jīng)發(fā)展出ANAMMOX、SHANNON-ANAMMOX和CANON等工藝應(yīng)用于污水脫氮處理。

然而，由于厭氧氨氧化菌生長(zhǎng)緩慢和對(duì)環(huán)境變化敏感的特性，人們對(duì)于它們的了解還不夠深入，許多假設(shè)仍待進(jìn)一步驗(yàn)證，其中的科學(xué)問(wèn)題及其應(yīng)用前景仍待深入發(fā)掘。首先，如何獲得厭氧氨氧化菌的純培養(yǎng)，是否能找出浮霉菌門(mén)以外的能夠進(jìn)行厭氧氨氧化的細(xì)菌；其次，關(guān)鍵酶類的體外解析是否可以幫助完善這類細(xì)菌的代謝通路；再者，以亞硝酸為電子受體的厭氧氨氧化菌和以其他如鐵[65]、錳[66]、硫氧化物[67]等為電子受體的厭氧氨氧化菌的遺傳代謝機(jī)制的差異等。

經(jīng)典方法的迅速革新和新興技術(shù)的快速發(fā)展為解決這些問(wèn)題提供了前所未有的機(jī)遇。一方面，作為微生物富集首要途徑的厭氧生物反應(yīng)器已經(jīng)愈發(fā)高效和成熟，與此同時(shí)，穩(wěn)定同位素探針（stable isotope probing,SIP）技術(shù)在環(huán)境微生物培養(yǎng)方面的應(yīng)用也會(huì)大大加速主導(dǎo)菌群的鑒定[68]；另一方面，合成生物學(xué)的發(fā)展使得越來(lái)越多的關(guān)鍵酶類能夠在體外表達(dá)，甚至可以重構(gòu)其代謝通路驗(yàn)證其功能，為厭氧氨氧化過(guò)程中關(guān)鍵酶的解析提供了極大的便利。

作為全球氮循環(huán)中至關(guān)重要的一環(huán)，厭氧氨氧化的闡釋不僅可以幫助完善微生物種群與功能之間的聯(lián)系，而且在如何有效地進(jìn)行環(huán)境的利用和保護(hù)及探討整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)對(duì)于全球氣候變化的響應(yīng)方面也具有十分重要的意義。