宋玉杰，雷鐵池

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北武漢430060）

近十年，許多新型發(fā)光二極管（Light-emitting diodes，LED）光療設(shè)備進(jìn)入臨床，對(duì)多種皮膚?。ㄈ琊畀彙⑵ぱ?、甚至禿發(fā)等）的治療取得積極滿意療效[1］。不同波長(zhǎng)的LED光有著不同的光生物調(diào)節(jié)（Photobiomodulation）活性，譬如藍(lán)光（400～470 nm）能抑制皮脂分泌、還能殺滅痤瘡丙酸桿菌用于治療尋常型痤瘡[2］；紅光（630～700 nm）可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocyte，KC）釋放促炎因子用于治療玫瑰痤瘡[3］；黃光（570～590 nm）可收縮血管消除皮膚紅斑用于減輕激光術(shù)后皮膚紅腫[4］。然而，也有報(bào)道稱LED藍(lán)光照射可誘導(dǎo)皮膚出現(xiàn)色沉等不良反應(yīng)[5］。相反，LED黃光照射又能抑制皮膚黑素合成[6］。本研究用3種LED（紅、黃、藍(lán)）光照射體外分離培養(yǎng)的人表皮片，同時(shí)與經(jīng)典光療UVA與308 nm準(zhǔn)分子光（308 nm excimer light，308 nm EL）進(jìn)行平行比較，系統(tǒng)觀察LED光照射對(duì)人表皮內(nèi)黑素細(xì)胞（Melanocyte，MC）數(shù)目、樹(shù)突長(zhǎng)度以及細(xì)胞增殖影響。最后用LED光照射小鼠尾部皮膚進(jìn)一步體內(nèi)觀察黑素顆粒含量與分布的變化，旨在闡釋LED光療是否存在直接引起皮膚色素沉著不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 人包皮組織標(biāo)本15例獲自本院泌尿外科門(mén)診行包皮環(huán)切術(shù)的患者，男，年齡18～25歲。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書(shū)。小鼠melan-a MC由美國(guó)國(guó)家健康研究院Dr.Vincent J.Hearing提供。C57BL6小鼠18只，雌性，6周齡，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄（RT）和PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；EdU，EpiLife培養(yǎng)基及人KC生長(zhǎng)添加成分（HKGS）購(gòu)自（美國(guó)ThermoFisher公司）；L-3，4-二羥基苯丙氨酸（Dopa）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗c-kit抗體（貨號(hào)：MA5-12944，美國(guó) ThermoFisher公司）；抗 Dct抗體（αPEP8h）和抗 Tyrp-1（αPEP1h）由 Dr.Vincent J.Hearing惠贈(zèng)。本研究使用光源：UVA光（350 nm，美國(guó)Daavlin靶向光療儀）、308 nm EL（日本USHIO光療儀）、430 nm藍(lán)光/585 nm黃光/630 nm紅光（LED光療儀，武漢博健光電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 人表皮片制備與多巴染色 取健康人包皮環(huán)切術(shù)后組織，將標(biāo)本剪成1 cm×1 cm大小，置于0.25%Dispase酶中4℃消化過(guò)夜。次日用鑷子將表皮與真皮撕開(kāi)，棄去真皮。角質(zhì)層向上基底層向下平鋪置于培養(yǎng)皿中，滴加EpiLife完全培養(yǎng)基于表皮片上。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的參數(shù)：UVA（5 J/cm2）、308 nm 準(zhǔn)分子光（250 mJ/cm2）、LED紅光（108 J/cm2）、LED 黃光（18 J/cm2）、LED 藍(lán)光（48 J/cm2），對(duì)皮片進(jìn)行照光處理。將處理好的表皮片PBS洗2次，冷丙酮固定30 min，PBS洗3次，置于0.1%多巴染液中37℃避光孵育4 h，乙醇逐級(jí)脫水，將基底層向上角質(zhì)層向下，置于載玻片上，中性樹(shù)膠封片，正置顯微鏡下觀察MC的數(shù)目及形態(tài)。每個(gè)視野下隨機(jī)選取50個(gè)多巴染色陽(yáng)性的MC，測(cè)量單個(gè)MC樹(shù)突長(zhǎng)度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與照光 RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、200 nmol佛波酯、100 μmol/L 二巰基乙醇、2 nmol/L谷氨酰胺）在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長(zhǎng)80%融合，吸出培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入1 mL PBS，燈管照射距離為5 cm。照射后立即更換新鮮培養(yǎng)基。光療參數(shù)在表2下備注。照光后繼續(xù)培養(yǎng)8 h抽提細(xì)胞總RNA。

1.2.3 動(dòng)物模型 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組，每組3只，即假照射組，UVA組，308 nm EL組和3種LED光組。小鼠尾巴背側(cè)進(jìn)行照光，燈管距小鼠尾巴背部距離為10 cm，隔日1次，共3次。照光完成后2 d CO2窒息處死小鼠，予超凈工作臺(tái)分離小鼠尾巴皮膚組織，4%多聚甲醛固定。

1.2.4 Fontana-Masson染色 參照本室以前報(bào)道的方法[7］。制備石蠟切片，行Fontana-Masson染色染色，顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.5 EdU標(biāo)記及免疫熒光染色 將照光處理的表皮片角質(zhì)層朝上，基底層朝下置于EpiLife培養(yǎng)基中，加入10 μmol/L的EdU，予培養(yǎng)箱中孵育8 h，用于摻入標(biāo)記增殖的細(xì)胞。隨后用一抗：Dct（1∶200）、Tyrp-1（1∶200）、c-kit（1∶100）4℃冰箱避光孵育24 h，最后孵育二抗，用含DAPI染液孵育顯示細(xì)胞核?；讓映辖琴|(zhì)層朝下置于載玻片上封片。熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.6 qPCR檢測(cè)Rac1和RhoA mRNA的表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。引物序列：鼠Rac1，正向引物5’-AGAGTACATCCCCACCGTCT-3’，反向引物 5’-TAAGAACACGTCTGTCTGCGG-3’；鼠 RhoA，正向引物 5’-ACGGTGTTTGAA AACTATGTGG-3’，反向引物 5’-GACAGAAATGCTTGACTTCTGG-3’；鼠GAPDH，正向引物5’-GACAAAATGGTGAAGGTCGGT-3’，反向引物5’-GAGGTCAATGAAGGGGTCG-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 sec；95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，共40個(gè)循環(huán)。重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1 比較3種LED光與紫外線對(duì)MC樹(shù)突長(zhǎng)度及黑素合成的影響 為了能準(zhǔn)確觀察到MC對(duì)不同光療的反應(yīng)性，筆者制備人表皮片（維持體內(nèi)MC與KC共存狀態(tài)），并給予5 J/cm2UVA或250 mJ/cm2308 nm EL 照射，于照射后不同時(shí)間（0、2、6、8、12 h）對(duì)表皮片進(jìn)行多巴染色。結(jié)果顯示2種紫外線照射8 h后，MC形態(tài)變化最明顯，且兩極或多極細(xì)胞數(shù)

表1 UVA與308 nm EL照射后不同時(shí)間表皮片中兩極或多極MC數(shù)目比較 （±s）

表1 UVA與308 nm EL照射后不同時(shí)間表皮片中兩極或多極MC數(shù)目比較 （±s）

組別 0 h 2 h 6 h 8 h 12 h UVA 35.24±2.14 41.26±4.33 44.32±2.45 54.19±3.14 48.28±4.86 308 nm EL 34.74±2.34 45.60±3.48 47.11±2.87 63.52±1.99 52.01±5.36 t 0.194 2.95 2.53 5.09 2.79 P ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05

目較假照射組明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。為此，選擇照射后8 h，不同光源對(duì)人表皮片MC樹(shù)突長(zhǎng)度影響進(jìn)行平行比較，典型多巴染色照片見(jiàn)圖1。3種LED光照射對(duì)表皮片中MC數(shù)目及樹(shù)突長(zhǎng)度與假照射組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2，而UVA和308 nm EL照射組MC數(shù)目及樹(shù)突長(zhǎng)度與假照射組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），尤以308 nm EL組最為明顯。與假照射組相比，UVA和308 nm EL處理melan-a細(xì)胞Rac1 mRNA水平明顯升高，而Rho A mRNA變化不明顯；3種LED光照組Rac1變化不明顯，而Rho A表達(dá)水平增加，見(jiàn)表2。不同光療對(duì)小鼠尾部皮膚照射后發(fā)現(xiàn)僅UVA和308 nm EL處理組可見(jiàn)基底層沉積有大量黑素顆粒，而3種LED光療處理組未見(jiàn)黑素顆粒沉積，見(jiàn)圖2，表2。以上體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明唯有UVA和UVB對(duì)表皮MC存在顯著光生物刺激作用，而3種LED光療作用不明顯。

圖1 3種LED光與UVA/308 nm EL照射后表皮片中MC形態(tài)變化 a：假照射組；b：UVA組（5J/cm2）；c：308 nm EL組（250 mJ/cm2）；d：LED 紅光組（108 J/cm2）；e：LED 黃光（18 J/cm2）；f：LED 藍(lán)光（48 J/cm2）。標(biāo)尺：100 m。

表2 人表皮片不同光療照射后8 h MC樹(shù)突長(zhǎng)度、小鼠尾皮膚黑素含量以及melan-a細(xì)胞2個(gè)樹(shù)突調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平的比較 （±s）

表2 人表皮片不同光療照射后8 h MC樹(shù)突長(zhǎng)度、小鼠尾皮膚黑素含量以及melan-a細(xì)胞2個(gè)樹(shù)突調(diào)控基因mRNA表達(dá)水平的比較 （±s）

注：與假照射組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。melan-a細(xì)胞照射劑量分別為 UVA 5 J/cm2、308 nm EL 70 mJ/cm2、LED 紅光 5 J/cm2、LED 黃光 10 J/cm2、LED 藍(lán)光 10 J/cm2。

melan-a小鼠MC（mRNA水平）Rac1 RhoA假照射組 12.70±1.94 15.01±2.35 1.0±0.26 1.0±0.27 UVA 組 31.28±2.53** 19.09±2.70* 1.46±0.14* 0.89±0.08 308 nm EL 組 78.51±4.68** 45.06±5.86** 2.48±0.15** 0.64±0.16紅光組 8.20±2.03 12.10±1.55 1.19±0.14 3.13±0.25**黃光組 12.53±2.54 12.27±2.61 0.88±0.06 2.19±0.11**藍(lán)光組 8.99±1.20 13.34±2.57 1.23±0.08 3.18±0.28**組別 人表皮片MC樹(shù)突長(zhǎng)度（μm）小鼠尾皮膚黑素含量

2.2 308 nm EL對(duì)體外培養(yǎng)的人表皮片中MC增殖活性的影響 為了觀察308 nm EL照射后表皮MC是否發(fā)生增殖，筆者用EdU摻入法標(biāo)記人表皮片中增殖的細(xì)胞。同時(shí)，用MC特異性抗體：c-kit（未成熟MC標(biāo)志分子）、Tyrp-2/Dct（MC特異性譜系標(biāo)志分子）和Tyrp-1（成熟MC標(biāo)志分子）進(jìn)行免疫熒光染色[8-9］，見(jiàn)圖3。308 nm EL照射后的表皮片中，ckit+/EdU+和Dct+/EdU+共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于假照射組（P＜0.01），而 Tyrp-1+/EdU+共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量較低（P＞0.05）。這一結(jié)果提示UVB光療主要誘導(dǎo)未成熟的MC而不是成熟的MC增殖。

3 討論

圖2 3種LED光與UVA/308 nm EL照射C57小鼠尾部皮膚黑素含量和分布（Fontana-Masson染色）a：假照射組；b：UVA組；c：308 nm EL組；d：LED紅光組；e：LED黃光；f：LED藍(lán)光組照射劑量同圖1，隔日1次，共3次。標(biāo)尺：50 m。

圖3 MC和EdU雙標(biāo)免疫熒光染色 白色箭頭表示有代表性的MC和EdU+的雙標(biāo)免疫染色圖像（c-kit+和Tyrp-1+圖片未提供）。標(biāo)尺：50 m。統(tǒng)計(jì)每100個(gè)EdU+的細(xì)胞中c-kit+/Dct+/Tyrp-1+的細(xì)胞數(shù)目。＊＊表示P＜0.01。

近年來(lái)，許多新型的LED（主要提供420～650nm波長(zhǎng)的光源）光療設(shè)備被投入臨床，廣泛用于治療痤瘡、皮膚炎癥甚至脫發(fā)等多種皮膚病[1，10］。有研究表明藍(lán)光和紅-藍(lán)光有一定的抗炎和抗脂溢性作用，因此被用來(lái)治療輕度痤瘡[11］。然而，也有學(xué)者們擔(dān)心LED光在治療皮膚疾病時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)照射部位皮膚過(guò)度色沉的不良反應(yīng)[11］。為了闡釋LED光療是否真正地改變表皮MC的表型，筆者用分離制備的人表皮片模型（該模型保留著體內(nèi)MC與KC的生理聯(lián)系）觀察了紅、黃、藍(lán)3種LED光療對(duì)培養(yǎng)人表皮片MC形態(tài)學(xué)特征的影響。結(jié)果表明3種LED光照射組與假照射組比較未見(jiàn)樹(shù)突長(zhǎng)度延伸。相反，UVA和308 nm EL照射后樹(shù)突增加顯著。3種LED光療照射C57小鼠尾部皮膚觀察MC表型改變，結(jié)果與人表皮片結(jié)果一致。

已有研究顯示Rho家族小GTP酶（Rac1和RhoA基因）在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組中起關(guān)鍵作用。Rac1激活誘導(dǎo)樹(shù)突延伸，RhoA激活抑制樹(shù)突生成并促其收縮[12-14］。筆者用qPCR技術(shù)檢查了melan-a細(xì)胞在不同光療處理前后2個(gè)樹(shù)突相關(guān)調(diào)節(jié)基因的變化。結(jié)果提示3種LED光照不能上調(diào)促樹(shù)突形成的Rac1基因表達(dá)，相反抑制樹(shù)突生成基因RhoA表達(dá)水平增加。最后，筆者用EdU標(biāo)記和免疫熒光染色技術(shù)觀察了308 nm EL對(duì)人表皮片中MC增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)308 nm EL光療主要誘導(dǎo)未成熟的而不是成熟的MC增殖，這一觀察對(duì)提高UVB光療誘導(dǎo)白癜風(fēng)復(fù)色有重大意義。

綜上所述，3種LED光療對(duì)培養(yǎng)人表皮片MC未見(jiàn)有明顯的光生物刺激活性。文獻(xiàn)中零星報(bào)道的LED光療導(dǎo)致照射部位皮膚色沉是否與LED光照射有直接關(guān)聯(lián)，還是一種炎癥后色素沉著有待更進(jìn)一步證實(shí)。