陳其冰 王燕△ 陶澤璋 屈季寧 周濤

聲帶息肉、小結(jié)、任克水腫和聲帶囊腫等聲帶良性增生性疾病給廣大患者的生活質(zhì)量及工作效率造成了不同程度的負(fù)面影響[1]。聲帶良性增生性疾病主要由發(fā)聲不當(dāng)、用聲過度及慢性感染等多種因素共同作用導(dǎo)致，目前國內(nèi)外學(xué)者對這類疾病的病因?qū)W研究多集中在用聲習(xí)慣、生活方式和居住環(huán)境等方面，極少有研究探討聲帶良性增生性疾病與微生物之間的關(guān)系。本研究擬通過對聲帶良性增生性疾病患者聲帶表面分泌物中的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探討聲帶良性增生性疾病患者聲帶表面分泌物中菌群分布特點(diǎn)及其與該病發(fā)生、發(fā)展的可能關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 選取自2015年6月至2015年12月經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科確診的32例聲帶良性增生性疾病患者為實(shí)驗(yàn)組，其中，聲帶息肉23例，聲帶小結(jié)5例，任克水腫3例，聲帶囊腫1例；男14例，女18例，年齡22～56歲，平均41.36±8.46歲；以同期住院治療的33例無發(fā)聲異常且電子喉鏡檢查聲帶正常的甲狀腺腫物患者作為正常對照組，男13例，女20例，年齡29～55歲，平均45.77±7.25歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1月有糖皮質(zhì)激素或抗生素使用史；②近1月有上呼吸道感染或肺部感染；③血WBC>10.0×109個(gè)/L，或WBC<4.0×109個(gè)/L；④合并糖尿病、哮喘、過敏性鼻炎等疾病。所有對象于術(shù)前談話時(shí)均被告知聲帶表面分泌物采集步驟和用途，并簽署知情同意書。

1.2聲帶表面分泌物采集 實(shí)驗(yàn)組和對照組均為全麻手術(shù)，術(shù)前禁食禁水6小時(shí)，麻醉開始前予生理鹽水漱口2次；麻醉成功后在直達(dá)喉鏡下暴露聲門，用無菌咽拭子沿雙側(cè)聲帶表面各擦拭2次，取出咽試子將其頭部在盛有750 μl PBS的凍存管中旋轉(zhuǎn)20 s后封存；采集到的標(biāo)本均置于-80 ℃冰箱保存[2]。

1.3細(xì)菌基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 標(biāo)本于室溫下解凍后集中提取原核生物核酸組DNA，所用試劑盒為QIAamp DNA Microbiome Kit(Catalogue 51704, QIAGEN, Germany)，提取過程嚴(yán)格遵循操作說明書。得到的DNA產(chǎn)物用熒光光度法進(jìn)行質(zhì)量檢測，試劑盒為Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Assay Kit (Catalogue P7589, Invitrogen, USA)，以A260/280 nm 在1.8～2.0之間，且A260/230 nm>1.8作為標(biāo)準(zhǔn)。針對16S rRNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增引物序列采用了帶barcode標(biāo)簽的341F和806R[3]，PCR反應(yīng)過程為：98 ℃，1分鐘；35個(gè)循環(huán)下的98 ℃，10秒(變性)、60 ℃，5秒(退火)、72 ℃，30秒(延伸)；72 ℃延伸10分鐘。收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并置于4 ℃下儲(chǔ)存；通過凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(1%膠，100 V，60 min)確認(rèn)PCR擴(kuò)增情況后用TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit (TaKaRa,Code NO.9762)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收及純化，并利用Aglient2100生物檢測儀對得到的PCR終產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢。

1.4文庫構(gòu)建及DNA二代測序 基因組Shotgun文庫的構(gòu)建采用了TruSeq DNA Sample prep Kit試劑盒，文庫構(gòu)建指南采用TruSeq DNA Sample Sample Preparation Guide, Part # 15026486 Rev. C., 而后利用Illumina MiSeq 300PE測序平臺(tái)通過橋式PCR[4]進(jìn)行高通量二代DNA測序(采用CASAVAv.1.8.2和Fast QC軟件)，測序過程和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換的軟件為Real Time Analysis v.1.18及 MiSeq Reporter v.2.3.32。

1.5微生物分類 將得到的結(jié)果經(jīng)Flash v1.2.11軟件根據(jù)雙末端序列的重疊區(qū)域融合成一條序列，按照barcode序列將樣本序列加以區(qū)分后再去除barcode及引物序列即可得到一個(gè)操作分類單元 (operational taxonomic unit，OTU)[5]，最終獲得8 949 443個(gè)OTU。然后用QIIME v.1.9.1 軟件下屬的extract_barcode.py, split_library_fastq.py腳本對得到的OTU進(jìn)行質(zhì)控和篩選，下一步將合格的OTU用微生物測序分析軟件 (Ribosomal Database Project) 與Greengenes數(shù)據(jù)庫比對完成微生物學(xué)分類[5]，劃分標(biāo)準(zhǔn)為相似度達(dá)到97%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件包對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用GraphPad Prism 5.0作圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；兩組樣本符合正態(tài)分布，故用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)完成組間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組聲帶表面分泌物微生物測序得到的OTU數(shù)據(jù)比較 實(shí)驗(yàn)組的32個(gè)標(biāo)本共得到4 323 490個(gè)OTU，而對照組的33個(gè)標(biāo)本共得到4 625 953個(gè)OTU，實(shí)驗(yàn)組樣本平均OTU數(shù)為135 109.063±5 121.918個(gè), 對照組為140 180.394±6 172.230個(gè)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.531)。

2.2兩組菌落結(jié)構(gòu)比例比較 99%的菌群可以劃分到7個(gè)菌門中，在兩組中按相對豐度由多到少的順序排列一致,依次為：變形菌門(proteobacteria)、厚壁菌門(firmicutes)、擬桿菌門(bacteroidetes)、梭桿菌門(fusobacteria)、放線菌門(actinobacteria)、SR1和TM7(圖 1)。實(shí)驗(yàn)組和對照組7大細(xì)菌門總比例分別高達(dá)99.05 % 和99.12 %(表 1)。實(shí)驗(yàn)組中變形菌門、厚壁菌門均較對照組明顯增高(分別為P<0.001和P<0.01)，而實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門及SR1的相對豐度較對照組低，其中擬桿菌門所占比例在實(shí)驗(yàn)組和對照組中差異最為顯著(P<0.001)；TM7是在實(shí)驗(yàn)組和對照組中唯一無明顯差異的菌門(P=0.069)。

圖1 兩組菌群組成對比(菌門水平) 與正常對照組比較,?P<0.05;??P<0.01;???P<0.001

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組聲帶分泌物菌群各菌門水平的相對豐度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

3 討論

人體有90%的細(xì)菌來自微生物[6]，寄生在人體的細(xì)菌通過菌種間相互協(xié)同作用和拮抗作用(而不是某一特定細(xì)菌的單獨(dú)作用)可以影響疾病的發(fā)生與否[7]。在口腔內(nèi)，已發(fā)現(xiàn)的菌種超過1 000種，它們與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，然而仍有約一半菌種未被培養(yǎng)出來[8]，因此這部分細(xì)菌與人類健康之間的關(guān)系不得而知。喉腔同樣寄生著大量的微生物，研究[9]顯示喉癌患者喉咽的菌群結(jié)構(gòu)與正常人明顯不同；過去與聲帶病變有關(guān)的病原微生物研究主要集中在經(jīng)典的病原體上，如HPV和結(jié)核分支桿菌。隨著不依賴培養(yǎng)的生物信息分析技術(shù)的出現(xiàn)，關(guān)于微生物對宿主健康影響的研究已進(jìn)一步深入，2014年，Hanshew[10]對聲帶良性病變(囊腫、小結(jié)、息肉、任克水腫)組織用二代DNA測序技術(shù)進(jìn)行微生物學(xué)研究后提出，喉腔微生物多樣性的減少可能與這類疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但出于倫理因素，Hanshew并未采用正常人的聲帶組織作為對照。

本研究結(jié)果顯示聲帶良性增生性疾病患者與正常人聲帶表面細(xì)菌都主要來自變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門、SR1和TM7，在微生物總量上，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在菌群相對豐度上聲帶良性增生性疾病組變形菌門和厚壁菌門較對照組更高，而擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門及SR1的相對豐度在對照組中更高；以上6大菌門在兩組中的差異均較明顯，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)提示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故變形菌門和厚壁菌門對聲帶良性增生性疾病的發(fā)生、發(fā)展可能起到了重要作用，有可能是以某些屬于變形菌門和厚壁菌門的菌群為主導(dǎo)引起的內(nèi)環(huán)境紊亂而致病，比如：屬于厚壁菌門的鏈球菌被證明與眾多炎性疾病的發(fā)生有關(guān)；而擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門及SR1則可能起到了預(yù)防作用，比如：屬于擬桿菌門的普氏菌，有研究[11, 12]證明普氏菌可以通過它的粘附和調(diào)節(jié)代謝的作用來提高宿主細(xì)胞的免疫功能，從而減少炎癥的發(fā)生。另外，文中結(jié)果顯示，TM7是兩組間無明顯差異的唯一菌門，也是菌群相對豐度最低的菌門，因此，TM7對疾病的發(fā)生、發(fā)展可能并不重要；但TM7和SR1都是未能被體外培養(yǎng)的細(xì)菌門，稱為“候選門”[13, 14]，至今對它們下屬的細(xì)菌仍缺乏了解，亟待更多相關(guān)研究來填補(bǔ)空缺。

值得注意的是，本研究對菌群的分析只是在“門”這一水平，若深入到菌屬甚至菌種進(jìn)行分析或可發(fā)現(xiàn)更為明顯的差異菌屬或菌種；另外，本研究的樣本量還不夠大，對結(jié)果可能有一定影響。因此，未來需要更大樣本量進(jìn)一步探討菌群結(jié)構(gòu)對聲帶良性增生性疾病發(fā)生和發(fā)展的影響。