趙 璠

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院超聲科，遼寧 沈陽 110001)

對無法手術(shù)切除的中晚期肝癌或術(shù)后復發(fā)肝癌患者，目前臨床常采用傳統(tǒng)化療法或經(jīng)肝動脈化療方法[1]。因多數(shù)抗癌藥物不能很好地區(qū)別肝癌細胞與正常細胞,導致系統(tǒng)性毒性和負面影響，使得傳統(tǒng)化療方法受到一定局限。阿霉素(doxorubicin, DOX)為蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，是較常用的傳統(tǒng)化療藥物，廣泛用于治療各種腫瘤，包括乳腺、肺和甲狀腺等部位惡性腫瘤，但具有較強的心臟毒性[2-4]，用于全身及局部化療可引起心肌病變和充血性心力衰竭。另外，傳統(tǒng)介入治療將化療藥物直接經(jīng)肝動脈注入，因血流供應(yīng)不穩(wěn)定及血管內(nèi)流體靜脈壓較高，使得僅有小部分化療藥物可有效到達腫瘤部位。

作為一種新型靶向化療藥物載體，中空納米顆粒具有較高的比表面積和介孔結(jié)構(gòu)，且空隙率高，可將大量化療藥物裝載于納米顆粒內(nèi)部或附著于其表面，通過主動靶向或被動靶向的方式使藥物進入細胞，提高化療效果[5-6]。近年來，二氧化鋯作為新型納米材料已在牙科學和骨科領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但少見以其作為藥物載體治療腫瘤的報道[7-8]。本研究采用裝載化療藥物DOX的二氧化鋯納米顆粒及游離DOX治療兔VX2肝移植瘤，比較經(jīng)肝動脈及傳統(tǒng)外周靜脈途徑給藥對腫瘤的靶向性及抑瘤效果，并探討二氧化鋯納米顆粒載DOX是否可因二氧化鋯的藥物靶向性而降低DOX的心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 純種新西蘭大白兔26只[批準號：(2013)2013-112-2號]，雌雄不拘，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。將VX2荷瘤瘤株置于37℃恒溫水浴箱20 min進行復蘇。在無菌條件下將瘤株剪碎，而后任選1只實驗兔，以20 ml注射器吸取剪碎的瘤株組織塊，直接注射至其雙側(cè)后腿肌肉內(nèi)。10～15天后，待實驗兔后腿內(nèi)生長出實性腫塊后，取出瘤塊，選取周圍新鮮、生長較為旺盛的魚肉樣組織，以外科剪制成1～2 mm瘤塊，用于建立兔VX2肝移植瘤模型[9-10]。

建模時，采用Philips iU22型號超聲掃描儀，腹部探頭(頻率3.0～5.0 MHz)，進行定位并引導穿刺。將實驗兔全身麻醉后仰臥保定于自制操作臺，劍突下備皮、消毒，超聲實時引導下，將18G穿刺針送至預(yù)定種植部位，取1或2個瘤塊種植于兔肝內(nèi)。瘤塊種植后10～15天，經(jīng)CT掃描證實25只兔建模成功。

1.2 分組處理 將25只VX2肝移植瘤模型兔隨機分為5組，每組5只。A組經(jīng)肝動脈給予載DOX二氧化鋯納米顆粒，B組外周靜脈給予載DOX二氧化鋯納米顆粒，C組經(jīng)肝動脈給予游離DOX，D組經(jīng)外周靜脈給予游離DOX，E組為空白對照組。其中A、B組載DOX二氧化鋯納米顆粒劑量為3.7 mg/kg體質(zhì)量(所含DOX劑量相當于1.75 mg/kg體質(zhì)量)，C、D組游離DOX劑量為1.75 mg/kg體質(zhì)量；E組不做任何處理。

1.2.1 經(jīng)肝動脈給藥 采用Siemens Artis DTA DSA數(shù)字減影血管造影機，對A、C組經(jīng)肝動脈途徑給藥。將模型兔全身麻醉后仰臥保定于自制操作臺，確定其右側(cè)股動脈搏動部位，并對右側(cè)后腿內(nèi)側(cè)區(qū)域備皮、消毒、鋪巾。沿股動脈搏動部位鈍性分離，剝離股動脈。以18G穿刺針穿刺股動脈，而后引入5F導管鞘，行腹腔干造影顯示肝內(nèi)血管，將微導絲超選擇至腫瘤供血動脈，造影明確供血動脈，經(jīng)導管分別注入載DOX二氧化鋯納米顆粒及游離DOX。術(shù)畢加壓包扎并縫合[11]。

1.2.2 經(jīng)外周靜脈給藥 對B、D組經(jīng)耳緣靜脈分別注入載DOX二氧化鋯納米顆粒及游離DOX。

1.3 影像學評價 采用Toshiba Aquilion 64排螺旋CT掃描儀，給藥后1、3、6天對各組行CT檢查，觀察腫瘤生長情況及載DOX二氧化鋯納米顆粒影像學表現(xiàn)，選取肝內(nèi)腫瘤最大層面測量病灶長徑及短徑，計算腫瘤體積，體積=0.5×長徑×短徑2，并分別計算3天與1天、6天與3天、6天與1天腫瘤體積比。

1.4 組織學檢查 于末次CT檢查后處死模型兔，取出心臟組織，固定后沿軸位方向切成5 mm薄片，將標本于4%甲醛溶液中浸泡2天后取出，進行石蠟包埋。采用Nikon Eclipse TS100-F顯微鏡，對比觀察各組心臟標本組織學表現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析比較各組間腫瘤體積比的差異，兩兩比較采用LSD或SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

給藥后各時間點CT檢查均顯示載DOX二氧化鋯納米顆粒在肝腫瘤病灶內(nèi)呈略高密度影(圖1)。各組兔VX2肝移植瘤模型6天內(nèi)腫瘤體積持續(xù)增大，但增大程度不同，見表1。各組間給藥后3天與1天腫瘤體積比、6天與3天腫瘤體積比差異均無統(tǒng)計學意義(F=2.056、1.906，P=0.125、0.149)，給藥后6天與1天腫瘤體積比差異有統(tǒng)計學意義(F=4.230，P=0.012)；兩兩比較顯示，A組與B組間(P=0.012)、A組與C組間(P=0.019)、A組與D組間(P=0.024)、A組與E組間(P=0.001)及B組與E組間(P=0.029)差異均有統(tǒng)計學意義，而B組與C組間(P=0.358)、B組與D組間(P=0.420)、C組與D組間(P=0.907)、C組與E組間(P=0.176)及D組與E組間(P=0.143)差異均無統(tǒng)計學意義。

組織學檢查顯示， E組心肌細胞結(jié)構(gòu)正常(圖2A)，與之相比，A組心肌細胞幾乎無損傷(圖2B)，B組僅見心肌輕度擴張(圖2C)，C組可見心肌纖維斷裂，心肌細胞變形，出現(xiàn)明顯細胞水腫，細胞核位于一側(cè)(圖2D)，D組可見明顯心肌擴張及細胞核變形(圖2E)。

3 討論

近年來，聯(lián)合應(yīng)用載藥納米顆粒與介入治療方法(如肝動脈化療灌注、肝動脈栓塞、微波消融、射頻消融等)治療腫瘤的研究報道[12]逐漸增多。納米顆?？勺鳛榘邢蚧熕幬锏妮d體，利用其良好的靶向性、緩釋性、生物相容性及生物降解性，提高化療藥物的靶向性，以達到更有效地抑制腫瘤生長的目的[13]。

載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動脈給藥后到達腫瘤部位，并釋放DOX，使DOX在局部動脈血中達到較高的藥物濃度，可提高其抗腫瘤作用[14]。本研究結(jié)果顯示，載DOX二氧化鋯納米顆粒CT呈略高密度(圖1)，經(jīng)肝動脈給藥后6天，兔VX2肝移植瘤雖然仍持續(xù)生長，但腫瘤內(nèi)高密度的載DOX二氧化鋯納米顆粒周圍出現(xiàn)近似環(huán)形低密度區(qū)(圖1)，為腫瘤壞死區(qū)。

表1 各組VX2肝移植瘤模型兔不同時間腫瘤體積及體積比(±s)

表1 各組VX2肝移植瘤模型兔不同時間腫瘤體積及體積比(±s)

組別腫瘤體積(mm3)1天3天6天腫瘤體積比3天與1天6天與3天6天與1天A組5 471.86±4.356 758.34±2.279 988.37±7.331.27±0.081.46±0.401.85±0.45B組5 497.35±4.1610 335.51±6.6117 498.40±1.312.05±0.461.64±0.233.32±0.72C組3 090.66±2.008 132.92±6.3410 820.87±6.302.39±0.821.54±0.434.18±0.98D組5 329.43±3.3010 513.74±8.4220 258.65±1.292.12±0.852.30±1.353.88±0.91E組4 900.73±2.6113 853.18±1.1928 445.97±1.692.62±1.122.51±0.794.76±1.56

圖1 載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動脈注入兔VX2肝移植瘤后不同時間CT圖像 A、B.給藥后1天(A)及3天(B),載DOX二氧化鋯納米顆粒在病灶內(nèi)呈略高密度影(箭)； C.給藥后6天，病灶內(nèi)載DOX二氧化鋯納米顆粒周圍出現(xiàn)近似環(huán)形低密度區(qū)(箭)

圖2各組兔VX2肝移植瘤模型經(jīng)不同處理后6天心臟標本病理圖(HE，×200) A.E組，為空白對照，不做任何處理； B.A組，經(jīng)肝動脈注入載DOX二氧化鋯納米顆粒； C.B組，經(jīng)外周靜脈注入載DOX二氧化鋯納米顆粒； D.C組，經(jīng)肝動脈注入游離DOX； E.D組，經(jīng)外周靜脈注入游離DOX

表面被修飾后的納米顆粒可通過被動-主動靶向作用及受體-配體作用，在體內(nèi)實現(xiàn)對腫瘤的趨向，但易聚集于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的組織器官。通過外周靜脈給藥后，載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)全身血液循環(huán)到達肝內(nèi)[15]，在此過程中，部分納米顆粒被其他臟器的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬并釋放DOX，影響肝內(nèi)病灶局部的藥物濃度，使其治療效果不及經(jīng)肝動脈給藥。本研究中，A組給藥后6天與1天腫瘤體積比明顯低于B組。游離DOX經(jīng)肝動脈及外周靜脈給藥后，因其藥物靶向性較差，隨血液循環(huán)分布于全身各組織器官，無法實現(xiàn)肝內(nèi)局部化療目的，治療效果不佳。本研究中A組和B組給藥后6天與1天腫瘤體積比均明顯低于E組，而C組和D組均與E組間差異無統(tǒng)計學意義。通過介入手段，經(jīng)肝動脈將化療藥物超選擇性靶向注入腫瘤供血動脈，有利于提高化療藥物的靶向性。

DOX具有較強的心臟毒性。本研究組織學檢查發(fā)現(xiàn)，C組和D組心肌損傷程度相對于A組和B組更為嚴重，可見明顯的細胞水腫、心肌纖維斷裂及心肌擴張，而A組心肌細胞幾乎無損傷，提示載DOX二氧化鋯納米顆粒無論是通過肝動脈途徑還是外周靜脈給藥均較游離DOX更有利于降低DOX的心臟毒性；此外，載DOX二氧化鋯納米顆粒經(jīng)肝動脈給藥引起的心肌細胞損傷較經(jīng)外周靜脈給藥更輕微。

總之，本研究通過在體動物實驗發(fā)現(xiàn)，納米藥物載體與傳統(tǒng)介入超選擇性肝動脈化療相結(jié)合，可更好地延緩腫瘤生長，提高藥物靶向性，并有效降低DOX造成的荷VX2肝移植瘤兔心臟毒性。