榮 譽(yù)， 姚一博， 黨瑞華， 陳 宏， 雷初朝

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

毛色不僅是牛一種明顯的外貌特征，也是一種質(zhì)量性狀。毛色具有多樣性，觀察簡單的特點(diǎn)，因此可以用毛色作為品種劃分的依據(jù)，此方法具有簡單、快捷、成本低的優(yōu)點(diǎn)，這一點(diǎn)在其他動物中也有應(yīng)用[1-3]。由于牛個體經(jīng)濟(jì)價值大，牛品種的劃分與育種工作應(yīng)該在早期進(jìn)行，因此毛色便是一個理想的遺傳標(biāo)記；其次，牛的毛色性狀還可能與生產(chǎn)性能有關(guān)[4]，所以研究中國黃牛中與毛色有關(guān)的基因具有重要的意義。

牛的毛色與皮膚、毛發(fā)中黑色素與偽黑色素的相對數(shù)量和分布情況有關(guān)。黑色素廣泛存在于各種動植物中，并且黑色素是脊椎動物表層結(jié)構(gòu)的色素中含量最高的色素。黑色素可分為真黑色素和偽黑色素。其中，真黑色素為黑色或褐色。偽黑色素則大多為黃色和紅色，顏色相對較淺[5]。黑色素是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素體經(jīng)過一系列酶學(xué)反應(yīng)生成的。而黑色素體是在黑色素細(xì)胞內(nèi)的高爾基體—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—溶酶體復(fù)合物(GERL complex)內(nèi)形成，本身并無活性，無法產(chǎn)生黑色素[6]。黑色素是由酪氨酸激酶(tyrosinase，TYR)催化酪氨酸羥化而啟動的一系列生化反應(yīng)而合成的。

酪氨酸相關(guān)蛋白酶1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)基因?qū)φ婧谏氐男纬删哂兄匾饔肹7-8]。有研究表明，TYRP1基因可以影響黑色素的合成[9]，且在控制黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素類型的關(guān)鍵步驟中起催化作用[10]。由于不同物種間以及同一物種內(nèi)不同個體間均有相似的毛色類型，因此認(rèn)為不同動物中都存在關(guān)于毛色變異的遺傳基礎(chǔ)[6]。目前TYRP1基因影響毛色的具體機(jī)制尚不清楚，但是研究TYRP1基因的多態(tài)性對培育特定顏色的品種仍具有重要意義。Berryere等[9]研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因的突變(g.1300C>T)與徳科特牛的棕色被毛性狀有關(guān)，該突變導(dǎo)致組氨酸替換為酪氨酸，其中CC基因型被定義成BB，CT基因型被定義成Bb，TT基因型被定義成bb，bb基因型個體表現(xiàn)為棕色被毛性狀。但該位點(diǎn)并沒有在中國黃牛中進(jìn)行過驗(yàn)證。本試驗(yàn)旨在利用測序等技術(shù)驗(yàn)證該突變是否與中國黃牛被毛顏色存在相關(guān)性，從而為中國黃牛的純種鑒別、保種選育等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)采集了1 143個牛耳組織樣品，其中包括14個中國黃牛品種(991頭)和48頭安格斯牛、104頭婆羅門牛。采用常規(guī)苯酚—氯仿法抽提基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

選用Berryer等[9]報道的1個與徳克特牛的棕色毛色相關(guān)的SNP引物信息(表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

25 μL PCR擴(kuò)增體系：2×Mixture(上海寶生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，64 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min，放置于4 ℃條件下保存。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶染色)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.2.1 測序、基因型及基因頻率的計(jì)算 將符合測序要求的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Chromas 2.3軟件進(jìn)行比對和校正。將所有黃牛的SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算黃牛的基因型與等位基因頻率。

1.2.2 對各群體進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)以及多態(tài)性分析 統(tǒng)計(jì)16個牛品種的基因型頻率與基因頻率，使用POPGENE軟件檢驗(yàn)種群是否達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(Version 3.2)，并計(jì)算多態(tài)性信息(PIC)含量[11]。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 TYRP1基因的基因型頻率和等位基因頻率分析

本研究分析了TYRP1基因第7外顯子上的突變(g.1300C>T)在991頭中國黃牛(14個品種)、48頭安格斯牛、104頭婆羅門牛中的變異情況。從表2、表3可以看出，BB基因型仍然是優(yōu)勢基因型，在不同的群體中B等位基因頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于b等位基因頻率。同時，筆者還發(fā)現(xiàn)，紅棕色和褐色群體的b等位基因頻率高于其他群體，其中紅棕色個體中，b等位基因頻率為0.077，B等位的基因頻率為0.923。褐色個體中，b等位基因頻率為0.125，B等位基因頻率為0.875。但是，本研究結(jié)果顯示，此突變與不同毛色的牛并無相關(guān)性。

表2 黃牛TYRP1基因型頻率、等位基因頻率及多態(tài)性分析

2.2 TYRP1基因遺傳多態(tài)性信息分析與Hardy-Weinberg平衡的檢驗(yàn)

通過對16個品種進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)群體多態(tài)性均為低度多態(tài)(PIC<0.25)(表2)。Hardy-Weinberg平衡分析(表2)表明，該突變在思南牛、關(guān)嶺黃牛、大別山牛、皖南牛、西藏牛、文山牛、安格斯牛、秦川牛、渤海黑牛、魯西黃牛、南丹牛、隆林牛、獨(dú)龍牛、云嶺牛、婆羅門牛中達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，而務(wù)川黑牛和大別山牛均未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)。

表3 不同毛色牛的基因型頻率與等位基因頻率

3 討 論

在牛羊中等偶蹄動物中，對TYRP1基因多態(tài)性與毛色性狀相關(guān)性的研究較多，大量研究表明，TYRP1基因與毛色性狀存在相關(guān)性。Gratten等[12]發(fā)現(xiàn)索爾艾綿羊TYRP1基因外顯子4上含有非同義突變(g.869A>G)與淺色表型呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性，但在不同毛色個體表達(dá)量不同。在豬與鳥類中也有類似報道[13-14]。此外，在朗德鵝中通過定量PCR發(fā)現(xiàn)，TYRP1在不同羽色中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，在顏色較深的個體中表達(dá)量更高[15]。Berryere等[9]發(fā)現(xiàn)，德克斯特牛TYRP1基因編碼區(qū)的一個單核苷酸多態(tài)性(H424Y)與其棕色表型相關(guān)。

從表2可以看出，大別山牛、安格斯牛、秦川牛、隆林牛多態(tài)性較高，隆林牛的遺傳多樣性最高(0.242)，這可能與當(dāng)?shù)亻_展的保種工作有關(guān)[16]。從群體遺傳多態(tài)性角度分析，如果PIC低說明群體在該位點(diǎn)遺傳變異低，有較低的選擇余地，不可以利用該位點(diǎn)進(jìn)行與毛色性狀相關(guān)的標(biāo)記輔助選擇。群體PIC低還說明遺傳變異小，可獲得的遺傳進(jìn)展相對較少。因此，該位點(diǎn)不能作為中國黃牛毛色基因的輔助標(biāo)記選擇。

本研究結(jié)果顯示，不同毛色的個體與TYRP1第7外顯子上的突變(g.1300C>T)沒有相關(guān)性。從表3中可以發(fā)現(xiàn)，b等位基因在不同毛色群體中均表現(xiàn)為低頻，且與紅棕色表型無相關(guān)性。同時，筆者發(fā)現(xiàn)b等位基因在深色表型群體中的頻率高于淺毛色群體。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在不同顏色的蒙古馬的皮膚組織細(xì)胞中TYRP1基因呈現(xiàn)差異性表達(dá)，板栗色蒙古馬的TYRP1基因相對表達(dá)量最高。Makiko等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在白化病人的皮膚組織中TYRP1基因的相對表達(dá)量顯著低于正常個體。因此，筆者認(rèn)為TYRP1基因第7外顯子上的突變(g.1 300C>T)與紅棕色毛色不相關(guān)，但可能對毛色具有一定的調(diào)控作用。