謝 鑫， 蔣君梅1， 王 勇1， 任明見

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025； 2.國家小麥改良中心貴州分中心， 貴州 貴陽 550025)

真菌在自然界廣泛分布，與人類生活的各個方面都有著密不可分的聯(lián)系[1]。因此對真菌進(jìn)行研究，尤其對真菌的基因功能進(jìn)行研究具有重要意義。通過對真菌DNA進(jìn)行遺傳改造是基因功能研究的重要技術(shù)，目前，對絲狀真菌進(jìn)行遺傳改造的方法主要有PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(A.tumeafeiensmediatedtransformation, ATMT)、電擊轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化等[2-3]。基因敲除是研究基因功能的手段之一，利用同源重組原理對感興趣的基因進(jìn)行敲除，通過觀察敲除突變體的表型變化從而明確該基因的功能，最終實(shí)現(xiàn)改良或防治真菌的目的。目前，常用的基因敲除的方法有： 1) 同源重組基因敲除，即利用基因兩側(cè)的同源臂在位點(diǎn)特異性DNA重組酶的作用下進(jìn)行基因敲除，該法是最普遍的基因敲除方法； 2) 基因沉默(RNA silence)誘導(dǎo)的基因敲除，即通過構(gòu)建小的雙鏈RNA片段干擾基因的表達(dá)，并且這種干擾效應(yīng)會持續(xù)“傳遞”到子代細(xì)胞，從而造成基因敲除； 3) 轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法，即通過轉(zhuǎn)座子在基因組中 “跳躍”，從而造成染色體的畸變或基因的缺失[4-6]。以上的基因敲除方法最終都需要篩選標(biāo)記對敲除突變體進(jìn)行篩選，絲狀真菌基因敲除時常用的篩選標(biāo)記有潮霉素、氯嘧磺隆(SUR)和G 418等[7]，存在篩選效率低、假陽性率高等缺點(diǎn)。因此，本研究對此做了改進(jìn)，利用同源重組的原理，采用兩步法PCR進(jìn)行基因敲除，并利用潮霉素和綠色熒光蛋白(GFP)同時進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，大大提高了篩選效率，其操作流程見圖1。

圖1 本研究流程圖

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株

稻瘟菌菌株GUY 11野生型菌株來自貴州大學(xué)植物病理學(xué)教研室。

1.1.2供試試劑

燕麥、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、酵母提取物、瓊脂粉、溶菌酶(sigma)PEG 8000(sigma)、Tris-HCl、氯化鈣、氯化鈉、山梨醇、FastPfu Fly高保真酶(全式金)、pEASY-Blunt克隆載體(全式金)、苯酚、氯仿、乙醇、CTAB、金剛砂(sigma)等。

1.1.3培養(yǎng)基

燕麥培養(yǎng)基(1 L)：燕麥30 g(用料理機(jī)打碎)，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

完全培養(yǎng)基(CM)：水解酪蛋白6 g，酵母提取物6 g，蔗糖10 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

酶解液：0.1 g溶菌酶溶解并定容至10 mL 0.7 M NaCl溶液中，抽濾除菌。

1×STC(200 mL)：山梨醇43.6 g，50 mM Tris-HCl, pH=8.0 10 mL，50 mM CaCl210 mL，蒸餾水定容至200 mL，121 ℃滅菌20 min。

40%PTC(100 mL)：PEG 8000 4 g加1×STC定容至100 mL，抽濾除菌。

TB 3 培養(yǎng)基(1 L)：酵母提取物6 g，水解酪蛋白6 g，蔗糖200 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所涉及的主要儀器有：離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡、光照培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、搖床、料理機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1稻瘟菌培養(yǎng)

將稻瘟菌接種于新鮮的燕麥培養(yǎng)基，25 ℃光照培養(yǎng)8～10 d。

1.2.2PCR擴(kuò)增、連接等分子生物學(xué)方法

用于載體構(gòu)建的DNA 擴(kuò)增所用的PCR 擴(kuò)增體系如下：5×buffer 10μL， FastPfu Fly DNA Polymerase 1μL (全式金)，2.5 mmol dNTPs 4μL，DNA 模板 0.5μL (約 5 ng 質(zhì)粒 DNA)，10μmol 上下游引物各1μL，ddH2O 32.5μL。

以下為PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min，35 個循環(huán)(95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 0.5～1 min(根據(jù)DNA 片段長度確定)，72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后，連接到 pEASY 載體。采用1%瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

HPH-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建采用如下方法進(jìn)行：分別用TRP-F/HYG-GFP-R和HYG-GFP-F/GFP-T引物對從pBHt 2載體和PYBA 1132載體擴(kuò)增帶有啟動子TrpC的潮霉素HPH片段和GFP片段，并以此PCR產(chǎn)物HPH和GFP片段為模版，用TRP-F/GFP-T引物擴(kuò)增，獲得融合的HPH-GFP片段，并將該片段插入全式金pEASY-Blunt克隆載體，挑單克隆DNA測序鑒定沒有突變的克隆保存?zhèn)溆?圖2)。

1.2.3稻瘟菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體制備：將新鮮的固體培養(yǎng)基上的菌絲切成小塊，置于液體完全培養(yǎng)基中，28 ℃ 120 r·min-1培養(yǎng)3 d；過濾收集菌絲，用0.7 M NaCl溶液洗滌菌絲去除殘余培養(yǎng)基；將菌絲轉(zhuǎn)移至溶菌酶溶液中， 30 ℃ 90 r·min-1裂解3～4 h，鏡檢原生質(zhì)體裂解情況，用 1×STC洗劑重懸原生質(zhì)體至 5 × 107個·mL-1。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：采用40% PEG(PTC)對原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 200μL原生質(zhì)體與100μL PCR產(chǎn)物，孵育 20 min；加入PTC 1.5 mL，孵育20 min；最后加入TB 3培養(yǎng)基，28 ℃，90 r·min-1搖床上復(fù)蘇12 h。

圖2 HPH-GFP融合表達(dá)載體

表1 引物列表

引物名稱 引物序列(5’-3’)TRP-FGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAAHYG-GFP-RCTCGCCCTTGCTCACCATTTCCTTTGCCCTCGGACGAGTHYG-GFP-FACTCGTCCGAGGGCAAAGGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGFP-TTCACTTGTACAGCTCGTCCATM13-FTGTAAAACGACGGCCAGTM13-RCAGGAAACAGCTATGACCHY-FGCCGTGGTTGGCTTGTATGFP-RTCGCCGGACACGCTGAAMoNACα_UAAGGAATCTTTGGGACTMoNACα_AFTATCCAATCGGCATTAGGGMoNACα_ARACTGGCCGTCGTTTTACATTTCGCGGGTGGTCAAMoNACα_BFGGTCATAGCTGTTTCCTGACACTCGGTCTTGGTTTATTGMoNACα_BRTGAGGACGGAGCGGTAGMoNACα_NFGACCGCCGTCATCCACTMoNACα_NRTCACCGAAGACGCTGTAATGMoNACα_DBCCTGGCAGTCTCAAT

1.2.4稻瘟菌DNA的提取

采用微量法提取法對稻瘟菌DNA進(jìn)行提取，方法如下：在1.5 mL離心管中 加入約100μL 金剛砂，加入400μL CTAB提取buffer(CTAB 10 g，Tris 6.06 g，EDTA 1.46 g，NaCl 0.5 g，加水定容到500 mL)，用滅菌的棉簽刮取適量菌絲放入管中，加入400μL的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，把離心管置于37 ℃搖床250 r·min-1搖1 h，13 000 r·min-15 min，吸取250μL 上清液，加入800μL 無水乙醇，-20 ℃沉淀30 min，70%乙醇洗1次，室溫晾干，加入50μL ddH2O溶解DNA，取1μL進(jìn)行PCR。

1.2.5引 物

本研究所用引物見表1。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)包括兩輪PCR，其具體操作流程如圖3所示。

2.1 第一輪PCR擴(kuò)增

分別用HYG-GFP-F/GFP-T和TRP-F/HYG-GFP-R引物對從PYBA 1132載體和pBHt 2載體擴(kuò)增GFP片段(720 bp)和帶有啟動子TrpC的潮霉素HPH片段(1 352 bp)(圖4泳道2和3)。然后用M 13-F/M 13-R引物從HPH-GFP融合表達(dá)載體上克隆出HPH-GFP片段，備用(圖4泳道4)。分別用基因上、下游片段特異引物AF/AR和BF/BR對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中AR引物和BF引物5’端分別加ACTGGCCGTCGTTTTACA和GGTCATAGCTGTTTCCTG接頭序列，得到基因上下游特異片段(圖3)。

2.2 第二輪PCR擴(kuò)增

分別用第一輪PCR所得到的HPH-GFP片段和基因上下游特異片段為模版，以引物AF/GFP-R和HY-F/BR擴(kuò)增，得到2個上下游片段 HPH-GFP的嵌合體片段，1∶1混合2個片段(圖3)，然后用嵌合體片段進(jìn)行真菌遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 稻瘟菌NACα基因敲除

為檢驗(yàn)本研究方法的可行性，用本方法對稻瘟菌NACα基因進(jìn)行敲除，NACα基因序列來自于稻瘟菌數(shù)據(jù)庫(http://fungidb.org/fungidb/)，具體步驟如下：

注：A為轉(zhuǎn)化子PCR鑒定；1,2為泳道為野生型基因組對照；3，4為轉(zhuǎn)化子基因組DNA；5為水對照。B為轉(zhuǎn)化子熒光鑒定。圖5 轉(zhuǎn)化子的鑒定

圖3 兩步PCR法構(gòu)建基因敲除流程圖

注：1為泳道為陰性對照；2為泳道為GFP片段；3為泳道為HPH片段；4為泳道為HPH-GFP片段；M為Marker。圖4 HPH-GFP融合片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

1) 經(jīng)過第一輪PCR分別擴(kuò)增MoNACα基因上下游片段：分別用引物MoNACα_AF/ MoNACα_AR和MoNACα_BF/ MoNACα_BR從稻瘟菌基因組中擴(kuò)增基因上游片段(595 bp)和下游片段(550 bp)；

2) 第二輪PCR擴(kuò)增形成MoNACα基因上下游片段與HPH-GFP的嵌合體：分別用從第一輪PCR得到的上下游產(chǎn)物和HPH-GFP片段為模版，以引物AF/GFP-R和HY-F/BR擴(kuò)增，得到2個上下游片段-HPH-GFP的嵌合體片段，1∶1混合2個片段，備用；

3) 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：將混合的片段轉(zhuǎn)入稻瘟菌原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，25 ℃培養(yǎng)1周，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。

2.4 轉(zhuǎn)化子鑒定

1) 轉(zhuǎn)化子DNA的PCR驗(yàn)證：用CTAB法提取轉(zhuǎn)化子DNA，并分別用MoNACα_UA/GFP-R、HY-F/ MoNACα_DB和MoNACα_NF/ MoNACα_NR這3對引物擴(kuò)增提取的轉(zhuǎn)化子DNA來驗(yàn)證是否為陽性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化子用MoNACα_UA/GFP-R、HY-F/ MoNACα_DB引物可以擴(kuò)增出條帶(圖5第3泳道)，而用引物MoNACα_NF/ MoNACα_NR則不能擴(kuò)增出條帶(圖5 A第3泳道)，相反野生型對照用MoNACα_NF/MoNACα_NR可以擴(kuò)增出條帶(圖5 A第1,2泳道)，說明第3泳道的轉(zhuǎn)化子為陽性，其MoNACα基因被敲除，而第4泳道的轉(zhuǎn)化子則為未敲除的陰性轉(zhuǎn)化子。

2) 用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子是否有GFP熒光：為進(jìn)一步確定是否敲除轉(zhuǎn)化子是否為陽性，用牙簽挑取陽性轉(zhuǎn)化子少許菌絲，打散到加水的載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化子是否有GFP信號，結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡下有GFP信號(圖5 B)，用熒光觀察的方法與PCR鑒定方法結(jié)果一致。由于用熒光鑒定免去了提取真菌DNA復(fù)雜繁瑣的程序，因而采用本研究進(jìn)行突變體鑒定更加高效而簡單。

3 結(jié)論與討論

隨著功能基因組學(xué)時代的到來，對基因的功能研究已經(jīng)變得越來越普遍。在絲狀真菌的研究中，通常采用同源重組的方法進(jìn)行基因敲除，然后采用抗生素等篩選標(biāo)記對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，最后采用提取轉(zhuǎn)化子的DNA，用PCR對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定[8]。轉(zhuǎn)化子鑒定工作復(fù)雜而繁瑣，對于動輒成百上千個轉(zhuǎn)化子鑒定，一一提取DNA，PCR鑒定費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)錢，雖然也有研究報道簡化的DNA提取方法，起到了減少工作量的目的，但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足快速鑒定的目的。因此，本研究采用GFP熒光標(biāo)記方法進(jìn)行檢測，使得轉(zhuǎn)化子鑒定工作效率大大提高，同時也減少了酚氯仿等試劑的使用，安全性也大大提高。

有研究采用三輪PCR的方法，形成基因敲除嵌合體轉(zhuǎn)化鐮刀菌獲得基因敲除突變體[9]，本研究采用兩步法PCR的方法進(jìn)行基因敲除，步驟進(jìn)一步簡化，有利于大規(guī)模的基因敲除工作。轉(zhuǎn)化子的篩選通常依賴標(biāo)記抗生素的篩選，也有報道采用失活聚酮合酶基因的方法作為標(biāo)記基因(該基因失活后會產(chǎn)生白化現(xiàn)象)[10]，這可以作為今后借鑒的思路。