(貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

黨參屬(Codonopsis)和金錢豹屬(Campanumoea)隸屬桔?？?Campanulaceae)，其中黨參屬約40種，金錢豹屬有5種1亞種，2個(gè)屬均主要分布于中國西南部[1]。近年來，隨著《Flora of China》出版、新種的發(fā)表及新的研究方法應(yīng)用于植物的分類鑒定，使得《中國植物志》記載的2個(gè)屬在物種數(shù)量及屬的界限方面都發(fā)生了顯著變化。在物種數(shù)量上，中國產(chǎn)黨參屬約48種[2-3]，金錢豹屬恢復(fù)了輪鐘花屬(Cyclocodon)。目前，金錢豹屬約2種1亞種，輪鐘花屬有3種[4]。近年來，由于一些新技術(shù)應(yīng)用于分類學(xué)研究，使得桔?？圃趯俚膭澐稚线€有一定的爭議，主要集中在黨參屬、細(xì)鐘花屬、金錢豹屬及輪鐘花屬[5-8]。

黨參屬和金錢豹屬的植物均可入藥，除了《中國藥典》收載的黨參(Codonopsispilosula)、素花黨參(C.pilosulavar.modesta)和川黨參(C.tangshen)外，同屬植物管花黨參(C.tubulosa)、球花黨參(C.subglobosa)、灰毛黨參(C.canescen)及新疆黨參(C.clematidea)等在不同的地區(qū)也常常作為“黨參”藥用。金錢豹屬(Campanumoea)的金錢豹(Cam.javanica)、小花金錢豹(Cam.javanicasubsp.japonica)及長葉輪鐘草(Cam.lancifolius)的根常作為“野黨參”、“土黨參”藥用，是貴州民間常用的滋補(bǔ)藥物。由于黨參屬和金錢豹屬植物的親緣關(guān)系比較接近，因此多數(shù)物種的植物形態(tài)，尤其是根部的形態(tài)比較相似，從而導(dǎo)致黨參類藥材容易混亂，也較難準(zhǔn)確鑒定。植物葉表皮特征具有重要的鑒定學(xué)意義，常常作為植物分類及葉類藥材的鑒定依據(jù)。通過文獻(xiàn)查閱，目前黨參屬及金錢豹屬植物的分類鑒定研究主要集中在外部形態(tài)、種子形態(tài)、花粉形態(tài)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)等方面[4-14]，尚未見到有關(guān)葉片表皮顯微特征的研究報(bào)道。因此，筆者對10種黨參屬及金錢豹屬植物葉片表皮進(jìn)行顯微觀察、測量及聚類分析，以了解不同物種之間的分類鑒定依據(jù)，制定分種檢索表，為該類植物的分類鑒定提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣品經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于貴陽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館(HGCM)，樣品來源詳見表1。實(shí)驗(yàn)儀器：OLYMPUS BX 41顯微鏡，OLYMPUS DP 72顯像系統(tǒng)。

1.2 方 法

用新鮮或干燥葉片撕取或刮取小塊表皮，水合氯醛透化，稀甘油裝片，顯微觀察。在顯微鏡下，應(yīng)用DP 2-BSW軟件測量30個(gè)相鄰表皮細(xì)胞和氣孔器的長、寬、周長和面積(長為細(xì)胞的長軸長度，寬為過長軸中心的垂直線長度，周長為繞細(xì)胞壁1周的長度，面積為繞細(xì)胞壁1周所包括的面積)以及10根非腺毛的長。拍攝典型葉表皮特征照片，繪制葉表皮特征圖。表皮特征相關(guān)術(shù)語參考張麗娟等[15]描述。數(shù)據(jù)處理用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，聚類分析用Euclidean。

表1 樣品來源

種名產(chǎn)地采集日期(年/月/日)憑證標(biāo)本黨參貴州威寧縣2013/05/10ZY130510管花黨參貴州赫章縣2013/05/31ZY130531小花黨參貴州威寧縣2013/08/02ZY130802羊乳貴州貴陽市2013/05/20ZY130520銀背葉黨參貴州江口縣2013/08/20ZY130820雞蛋參貴州威寧縣2013/08/03ZY130803松葉雞蛋參貴州盤縣2014/07/13ZY140713金錢豹貴州貴陽市2015/10/07ZY151007小花金錢豹貴州紫云縣2014/09/20ZY140920長葉輪鐘草貴州貴陽市2015/10/14ZY141014

2 結(jié)果與分析

2.1 表皮細(xì)胞特征

所觀察的10種植物葉表皮細(xì)胞靠近葉脈的細(xì)胞均為長條形，垂周壁平直或稍彎曲。上表皮未見氣孔器，表皮細(xì)胞按垂周壁形狀可分為2種類型，一類是平直型，細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，如圖1中的A 2、A 5及A 7。另一類是彎曲型，垂周壁彎曲，這一類型根據(jù)垂周壁彎曲程度又可以分為三小類：

注：A代表上表皮；B代表下表皮；1為黨參；2為管花黨參；3為小花黨參；4為羊乳；5為銀背葉黨參；6為雞蛋參；7為松葉雞蛋參；8為金錢豹；9為小花金錢豹；10為長葉輪鐘草。圖1 10種藥用植物表皮特征圖(標(biāo)尺=100 μm)

1) 微波狀彎曲，如圖1中的A 1和A 4；

2) 波狀彎曲，如圖1中的A 3和A 6；

3) 及深波狀彎曲，如圖1中的A 8、A 9及A 10。

下表皮均有氣孔器分布，所有物種的氣孔器呈不均勻分布，均以不定式為主，摻雜少量不等式，大小有差異。根據(jù)垂周壁形狀僅有彎曲型，這一類型根據(jù)垂周壁彎曲程度又可以分為三小類：

1) 微波狀彎曲，如圖1中的B 6和B 7；

2) 波狀彎曲，如圖1中的B 1、B 2、B 3、B 4及B 5；

3) 深波狀彎曲，如圖1中的B 8、B 9及B 10。

所觀察的黨參屬部分物種表皮被單細(xì)胞非腺毛，如黨參、管花黨參、小花黨參及銀背葉黨參，其中黨參和銀背葉黨參上、下表皮單細(xì)胞非腺毛相對較多，尤其銀背葉黨參下表皮密被單細(xì)胞非腺毛。管花黨參和小花黨參表皮單細(xì)胞非腺毛少見，其余觀察的黨參屬和金錢豹屬植物葉表皮均未見單細(xì)胞非腺毛。表皮細(xì)胞、氣孔器及毛被的特征及大小等詳見表2。根據(jù)葉表皮細(xì)胞的形態(tài)和大小及單細(xì)胞非腺毛的有無、多少及長度等特征，制定分種檢索表如下：

2.2 聚類分析

應(yīng)用SPSS軟件對細(xì)胞的周長和面積、氣孔器長、寬、周長和面積及非腺毛長的均值(見表2)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，輻冠黨參亞屬中的雞蛋參和松葉雞蛋參首先與黨參屬的其他種及金錢豹屬分開，金錢豹屬與黨參亞屬聚在一起，見圖2。

表2 10種植物的表皮細(xì)胞情況

種名 上表皮 下表皮 細(xì)胞大小(長×寬×周長/面積)均值μm/μm2垂周壁細(xì)胞大小(長×寬×周長/面積)均值μm/μm2垂周壁氣孔大小(長×寬×周長/面積)均值μm/μm2非腺毛上表皮非腺毛(長)均值/下表皮非腺毛(長)均值μm黨參(50.38～76.82)61.53×(21.55～56.28)32.92×(141.06～247.02)176.27/(503.53～2915.98)1660.46微波狀彎曲(33.70～73.37)54.12×(16.81～34.78)23.45×(102.83～233.98)153.77/(576.53～1752.3)1023.01波狀彎曲(18.77～27.44)23.01×(14.66～20.85)18.40×(60.44～76.21)67.29/(277.51～445.15)361.56(87.35～125.89)100.45/(84.06～127.42)108.74管花黨參(41.36～111.06)64.22×(24.82～63.15)42.93×(127.13～232.81)178.50/(663.50～2896.79)1610.64平直(114.78～215.31)155.09×(47.39～109.28)85.47×(110.48～329.50)194.37/(733.73～2724.79)1534.27波狀彎曲(19.77～29.82)24.37×(15.08～21.87)18.53×(56.42～78.98)67.78/(257.40～456.08)355.73(78.59～114.36)94.06/(57.79～135.43)109.72小花黨參(52.83～96.91)79.75×(21.92～89.45)41.89×(151.87～373.89)272.16/(1651.36～4104.84)2861.96波狀彎曲(45.53～78.34)60.86×(19.90～47.94)33.64×(111.35～355.90)206.49/(805.17～2665.17)1723.12波狀彎曲(20.44～26.77)23.09×(17.02～22.69)19.85×(63.09～78.07)71.21/(334.07～449.48)386.42(270.56～400.35)355.46/(460.87～570.06)508.84羊乳(49.86～94.25)66.98×(26.93～59.13)38.74×(136.10～199.37)174.74/(1120.63～3199.33)1980.74微波彎曲(39.81～63.95)56.28×(20.35～48.09)33.33×(107.15～252.54)179.43/(424.84～3102.01)1530.15波狀彎曲(23.75～32.61)27.70×(18.50～25.16)21.83×(74.38～89.13)80.25/(415.99～614.777)473.99無銀背葉黨參(32.02～58.51)46.99×(22.70～48.35)30.90×(118.12～226.08)156.44/(647.33～2683.94)1547.50平直(30.70～64.53)45.20×(14.12～28.98)22.20×(91.46～208.28)134.40/(418.17～1154.98)777.56波狀彎曲(26.06～33.72)29.49×(17.05～28.15)23.83×(74.57～93.83)82.59/(395.78～667.47)503.79(37.92～99.17)62.75/(100.99～165.21)133.78雞蛋參(95.16～160.92)111.16×(48.67～99.13)77.35×(217.79～415.23)316.25/(3592.35～8349.13)5977.95波狀彎曲(56.40～125.26)83.66×(34.64～65.99)49.35×(188.69～411.95)281.88/(1092.66～6480.69)4089.30微波彎曲(31.84～42.97)37.15×(23.28～31.60)26.63×(93.71～112.09)103.75/(616.48～1068.59)781.62無松葉雞蛋參(86.40～183.96)130.23×(36.49～73.25)51.25×(179.55～444.36)318.95/(2385.40～9961.29)5840.20平直(59.26～128.42)95.17×(23.59～49.19)35.13×(141.62～386.32)233.93/(814.91～4170.31)2220.29微波狀彎曲(24.28～39.04)31.84×(17.66～29.41)23.44×(66.84～102.52)88.45/(780.56～331.13)554.83無金錢豹(52.87～91.20)73.69×(25.43～74.51)46.45×(177.44～332.65)246.99/(588.70～3334.74)2169.72深波狀彎曲(45.09～107.58)77.81×(23.05～71.46)43.73×(55.09～573.64)247.00(309.62～5655.02)2177.16深波狀彎曲(23.08～30.09)26.02×(18.87～23.17)20.49×(72.36.～89.19)80.81/(298.76～550.98)421.57無小花金錢豹(59.58～96.71)81.30×(16.44～38.44)29.60×(288.91～148.46)224.87/(1477.23～3443.63)2374.95深波狀彎曲(49.34～90.32)67.05×(19.24～42.45)25.50×(97.00～396.05)247.98/(740.60～3083.89)1848.27深波狀彎曲(21.54～30.92)25.71×(15.49～24.34)18.72×(62.32～88.53)72.38/(257.62～614.38)394.01無長葉輪鐘草(46.03～84.76)64.51×(24.14～60.07)38.16×(153.50～279.85)209.59/(1393.76～2430.69)1807.90深波狀彎曲(49.12～81.31)61.33×(13.67～56.75)32.14×(103.85～334.56)201.10/(630.67～2488.01)1315.98深波狀彎曲(22.15～27.80)24.57×(15.44～21.76)19.75×(66.16～83.06)73.87/(292.93～503.07)405.22無

圖2 10種藥用植物聚類分析圖

3 結(jié)論與討論

本研究對黨參、管花黨參、金錢豹及長葉輪鐘草4個(gè)種分別選擇10株成熟葉片進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，所觀測的同種植物葉表皮細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，且對細(xì)胞和氣孔器的周長和面積的均值進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示均無顯著性差異。說明同種植物葉表皮特征是比較穩(wěn)定的，可以作為種的分類鑒定依據(jù)。由于許多葉表皮細(xì)胞并不是規(guī)則的幾何形狀，所以長寬的測定人為主觀因素較大，所得到的測定值不客觀，故在進(jìn)行聚類分析和編制檢索表時(shí)沒有列入考慮。

《中國植物志》[1]將黨參屬分為黨參亞屬、錐果黨參亞屬和輻冠黨參亞屬，金錢豹屬包括輪鐘花屬。按照這種分類處理，所觀察的黨參、管花黨參、小花黨參、羊乳、銀背葉黨參均屬黨參亞屬，雞蛋參和松葉雞蛋參屬于輻冠黨參亞屬。Qiang Wang等[6]于從分子和花粉角度認(rèn)為輻冠黨參亞屬應(yīng)該從黨參屬分出。Qiang Wang等[7]又將輻冠黨參亞屬從黨參屬中獨(dú)立出輻冠黨參屬。染色體資料表明輻冠黨參亞屬的染色體數(shù)目為2 n=14，有別于黨參亞屬的染色體數(shù)目2 n=16[7]。花粉研究表明，黨參亞屬的花粉粒類型為長溝類型，而輻冠黨參亞屬的花粉粒類型為短溝類型[5]。根據(jù)植物形態(tài)特征，黨參亞屬(花冠鐘狀，花冠淺裂，根蘿卜狀)與輻冠黨參亞屬(花冠輻狀，花冠裂片達(dá)基部，根球形或卵球形)有顯著差異。根據(jù)本研究觀察的葉表皮細(xì)胞大小，黨參亞屬(周長100～200μm，面積1 000～2 000μm2)與輻冠黨參亞屬細(xì)胞(周長280～350μm，面積4 000～6 000μm2)有顯著差異，聚類結(jié)果也顯示，輻冠黨參亞屬與黨參亞屬分別聚在不同的分支上，說明把輻冠黨參亞屬從黨參屬中獨(dú)立成輻冠黨參屬是合理的。

孫慶文等[9-10]研究報(bào)道，小花黨參與金錢豹及小花金錢豹的種子大小、形態(tài)及種皮紋飾相似，并認(rèn)為三者之間親緣關(guān)系較近。野外觀察兩種植物的葉極其相似，區(qū)別僅在于是否有毛，而柱頭和果實(shí)類型上，小花黨參(柱頭為三裂，果為蒴果)與金錢豹及小花金錢豹(柱頭五裂，果為漿果)顯著不同，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過觀察小花黨參、金錢豹及小花金錢豹葉表皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)顯著不同，小花黨參表皮細(xì)胞為波狀彎曲，而金錢豹及小花金錢豹為深波狀彎曲。

洪德元等[4]根據(jù)花粉形態(tài)和種皮特征從金錢豹屬中恢復(fù)了輪鐘花屬。Yun-Feng Zhang等[14]研究金錢豹屬和輪鐘花屬的染色體，發(fā)現(xiàn)金錢豹屬的染色體數(shù)目為2 n=16，而輪鐘花屬的染色體數(shù)目為2 n=18，染色體數(shù)目也表明兩者應(yīng)該分開。2011年出版的《Flora of China》[2]已將輪鐘花從金錢豹屬中獨(dú)立。洪德元[4]又根據(jù)花粉形態(tài)和分子數(shù)據(jù)結(jié)合外部形態(tài)再一次驗(yàn)證了輪鐘花屬是一自然類群。孫慶文[10]采用電子顯微鏡觀察金錢豹屬及輪鐘花屬種子，發(fā)現(xiàn)金錢豹及小花金錢豹種皮為條形網(wǎng)狀紋飾，長葉輪鐘草為孔穴型網(wǎng)狀紋飾。在植物外部形態(tài)方面，金錢豹和小花金錢豹(草質(zhì)藤本，宿存花萼著生于漿果基部)與長葉輪鐘草(草質(zhì)直立莖，花萼著生于果實(shí)中部)不同，但所觀察的金錢豹、小花金錢豹和長葉輪鐘草的葉表皮細(xì)胞垂周壁均為深波狀彎曲，為同一類型。