中南林業(yè)科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 41000

山莓(RubuscorchorifoliusL.f.)，又名三月泡，系薔薇科Rosaceae，薔薇亞科懸鉤子屬RubusL.中的一種落葉灌木[1-2]。山莓根、莖、葉、果實均可入藥。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛風除濕、解毒斂瘡的功效，主治痢疾、遺精、濕疹、毒蛇咬傷、閉經(jīng)痛經(jīng)、風濕腰痛、小兒疳積等癥[3-4]，未成熟果實性味微甘、酸、溫，具有化痰解郁、醒酒止渴、澀精益腎、助陽明目之功效，常用于替代覆盆子入藥做引[5-6]，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥。葉性微苦，具有解毒、消腫、斂瘡、清熱利咽等作用，主治咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥[7]。在湖南湘西山莓作為苗族藥治療腹瀉，療效確切[8]。目前湘西山莓葉及其揮發(fā)油的化學成分及抑菌活性雖見報道[9-10]，但考慮到生態(tài)環(huán)境的多樣性，意味著二次代謝產(chǎn)物的多樣性，本實驗對湘西張家界山莓葉提取揮發(fā)油，GC-MS鑒定化學成分, DPPH法評價自由基清除能力[11-12]，刃天青96孔板微量稀釋法測定抑菌活性[13]，試圖更詳細探明山莓葉揮發(fā)油其醫(yī)藥和保健作用的內(nèi)在本質(zhì)，以期更好地綜合開發(fā)利用湘西山莓資源，提供重要的參考依據(jù)。

1 材料

山莓葉采自吉首大學張家界校區(qū)后山，由吉首大學廖博儒教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物山莓R.corchorifoius的葉,陰干,粉碎后備用石油醚(沸程30～60 ℃)、無水硫酸鈉、氯化鈉、蒸餾水、DPPH自由基、無水乙醇、VC、蘆丁、卡拉霉素、刃天青(Resazurin)、甲醇以上試劑均為分析純Thermo DSQ-II GC-MS聯(lián)用儀(美國賽默飛科技公司)、紫外分光光度計、Multiskan FC酶標儀(美國賽默飛科技公司)、pH酸度計(HM-205日本TOA公司)、烘箱(DN-63日本yamato公司)、培養(yǎng)箱(PW/10-002 重慶實驗設備廠)、超凈工作臺(CCV-1311日本日立公司)、冰箱、高壓蒸汽滅菌器(SM-52、日本)1/萬天平(AEG-220日本島津)、水蒸氣蒸餾裝置、電子天平、真空干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥器、FD-1冷凍干燥機。

2 方法

2.1 山莓葉揮發(fā)油的提取 稱取600.00 g山莓葉粉于揮發(fā)油提取器中，加3000 mL蒸餾水加熱提取，收集蒸出液，再加入NaCl 直至蒸出液飽和，然后用30～60 ℃的石油醚萃取，無水硫酸鈉脫水，石油醚萃取液于37 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，即得山莓葉揮發(fā)油。

2.2 GC-MS檢測條件 色譜條件：石英毛細管柱BP×5(25 m×0·22 mm×0·25 μm)；起始溫度40 ℃,保持3 min, 以5.0 ℃/min的升溫速率升到220 ℃，保持5 min；進樣溫度230 ℃,分流比30∶1, 進樣量1 μL,載氣為氦氣,流速為1.0 mL/min;質(zhì)譜條件:離子源EI, 離子源溫度250 ℃,電子能量 70 eV,發(fā)射電流: 120 μA,掃描范圍30～500 amu。定性分析: Mainlib譜庫檢索,確定成分,峰面積歸一化法確定相對含量。

2.3 山莓葉揮發(fā)油清除DPPH自由基 準確稱取12.5 mg DPPH·無水乙醇溶解定容, 配制成50 μg/mL儲備液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，即為標準儲備液。分別取0、2、4、6、8 mL標準儲備液在25 mL容量瓶中定容，標準溶液濃度依次為：0、4、8、12、16 μg/mL。在517 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

稱取0.2325 g山莓葉揮發(fā)油于25 mL容量瓶中，無水乙醇溶解定容，再分別取0、0.1、0.25、0.5、1 mL于10 mL容量瓶中與5 mL濃度為40 μg/mL的DPPH標準液混合，乙醇定容，山莓葉揮發(fā)油濃度依次為0、93、232.5、460、930 μg/mL。517 nm處動態(tài)測定吸光度，根據(jù)標準曲線得到DPPH·殘留量。繪制不同濃度的揮發(fā)油與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

DPPH·殘留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%

式中：[DPPH·]T為某一時刻DPPH·的質(zhì)濃度；[DPPH·]T0為DPPH·的起始質(zhì)量濃度。

各自稱取5.00 mg蘆丁、Vc于分別100 mL容量瓶，無水乙醇定容，即得蘆丁、Vc儲備液。分別取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL儲備液于10 mL容量瓶，與5 mL濃度為40 μg/mL的DPPH標準液混合，乙醇定容，即分別得蘆丁、Vc系列溶液為0、2.5、5、7.5、10、12.5 μg/mL，搖勻。在517 nm處的吸光度，繪制不同濃度的Vc、蘆丁與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

2.4 刃天青顯色法檢測山莓葉揮發(fā)油抑菌活性 菌懸液的制作：各細菌株在實驗室活化后繼代培養(yǎng)，并于冰箱內(nèi)4℃下保存一部分。用之前先將各細菌株在NA培養(yǎng)基上活化，且以MHB繼代培養(yǎng)菌株2～3代，并在試驗的前一天繼代培養(yǎng)一次，以保證菌的生長能力達到最佳。用分光光度計測定每株細菌菌液的OD600(大腸桿菌在OD600=0.1時的菌濃約為108 CFU /mL，其他細菌參照此數(shù)值)。用MHB培養(yǎng)基將菌液稀釋到1×108 CFU/mL的濃度。取5 mL菌液和7.5 mL的刃天青指示劑儲備液混勻 ，用排槍吸取100 μL菌液加入96孔板，除無菌對照孔外。

供測試樣品和陽性對照的儲液的配制：將揮發(fā)油于-10 ℃條件下靜置24 h，冷凍分層，分離上下層。 用乙醇將揮發(fā)油、冷凍后揮發(fā)油的上下層及標準品配制成最大濃度為1.00 mg/mL的儲液，然后以倍比稀釋，共配制1.00～1.95 μg/mL十個濃度儲備液。將上述儲備液加入96孔板，每孔2 μL；留無菌對照孔和生長對照孔。

刃天青指示劑配制成750 μg/mL儲備液，分別取取5 mLMHB培養(yǎng)基和7.5 mL的刃天青指示劑儲備液混勻 ，用排槍吸取100 μL加入96孔板的無菌對照孔。

最低抑菌濃度(MIC)的測定：將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)。每5～6小時觀察一次，有細菌生長的孔逐漸由藍色變粉，其中無菌的陰性對照孔為藍色，細菌陽性對照空為亮紅色，以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度(MIC)值。

3 結果與分析

3.1 山莓葉揮發(fā)油的提取 水蒸氣蒸餾法提取山莓葉得到揮發(fā)油0.2325 g，山莓葉揮發(fā)油的得率為0.03875%。

3.2 山莓葉揮發(fā)油化學成分分析 山莓葉揮發(fā)油總離子流圖如圖1所示，其組成成分及相對含量見表1。由表1可知，確定了其中的19種成分，占總揮發(fā)油總量的98.49%，其中主要成分為4-甲基-2,5-二叔丁基苯酚(45.46%)，2,3-二甲基戊烷(19.79%)，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(18.09%)，2,5-十八碳二炔酸甲酯(2.54%)紫蘇醛(1.66%)等。

表1山莓葉揮發(fā)油化學成分分析

3.3 山莓葉揮發(fā)油DPPH法抗氧化活性 分光光度法測定DPPH標準系列溶液在517 nm處的吸光值，結果見圖2，作線性回歸分析，得到線性回歸方程為y=0.0351x+0.0445，相關系數(shù)R2=0.9991，表明DPPH自由基濃度與其吸光度呈即顯著正相關關系。

山莓葉揮發(fā)油、Vc和蘆丁對DPPH自由基均有清除能力，隨著樣品濃度的增加，清除效果越好,而且山莓葉揮發(fā)油和Vc的清除速度比蘆丁要快，如圖3、圖4、圖5所示, 當DPPH·自由基殘留率為50%時，山莓葉揮發(fā)油濃度為121.9 μg/mL 、Vc濃度為4.8 μg/mL、蘆丁為6.3259 μg/mL，由此可知山莓葉揮發(fā)油對DPPH自由基的清除能力明顯低于Vc和蘆丁，山莓葉揮發(fā)油對DPPH抗氧化活性相對較弱。

3.4 山莓揮發(fā)油抑菌活性 刃天青顯色抑菌活性測試結果見表2，表明山莓葉揮發(fā)油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌均有一定的抑菌作用，而且對痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度(MIC)達到31.25 μg/mL。揮發(fā)油冷凍下層對痢疾志賀氏桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為15.6 μg/mL，低于卡拉霉素標準品。

表2 刃天青顯色法抑菌實驗結果 (MIC，μg/mL)

4 討論

通過GC-MS技術對湘西張家界山莓葉揮發(fā)油的化學成分進行鑒定分析，可知其主要成分為酚類及其含氧衍生物(63.55%)，烷烴類(19.79%)，酯類(2.54%)醛類(1.66%)等，比較周雙德測定的山莓葉揮發(fā)油的主要成分烷類(62.71%)、酯類(7.57%)、酚類(2.6%)、醇類(2.17%)，程怡測定的主要成分烷類(37.4%)、醇類(16.33%)、酯類(6.52%)、酚類(2.6%)、測定成分及含量均存在差異，有待進一步研究。DPPH法結果表明湘西山莓揮發(fā)油抗氧化能力相對弱于蘆丁和Vc。 此外，刃天青96孔板微量稀釋顯色法與K-B紙片法相比較，分析方法靈敏，結果穩(wěn)定，需要的試劑和樣品量少，適合植物提取分離所得少量樣品的抑菌活性篩選，在實驗中發(fā)現(xiàn)山莓葉揮發(fā)油對痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度達到15.6 μg/mL，比卡拉霉素標準品抑菌效果更好，是一種潛在的抗菌藥源，有待進一步研究開發(fā)。綜上所述山莓葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化和良好的抑菌能力，作為天然抑菌劑和抗氧化劑具有良好的開發(fā)前景，同時也為湘西山莓開發(fā)利用提供理論依據(jù)。