黃金亮 張 帆 萬雪琴 鐘 宇

(1 四川農(nóng)業(yè)大學林學院，四川 溫江 611130；2 四川農(nóng)業(yè)大學風景園林學院，四川 溫江 611130)

芽變引起的葉綠體突變是一種自然發(fā)生的葉色變異現(xiàn)象[1-2]。很多彩葉植物都來源于自然芽變[3]，如紅楓(AcerpalmatumAtropurpureum)來自于雞爪槭(AcerpalmatumThunb)的自然芽變[4]；中紅楊(PopulusdeltoidsZhonghong)來自于美洲黑楊(Populusdeltoids)L2025的自然芽變[5]。目前葉色突變體常用于研究植物光合生理、葉綠素合成、遺傳轉化等方面[2]。葉色突變?nèi)琰S化、白化、紅色、超綠色等通常是由于葉片內(nèi)葉綠素和花青素的相對含量發(fā)生變化引起的，因此，芽變可能是由于葉綠體結構改變從而導致葉片光吸收和光合能力降低[6-8]。如Walker等[9]研究表明，白化突變體葡萄中的核酮糖二磷酸羧化酶(ribulose diphosphatecar boxylase, RUBP)的失活導致其光合能力降低；但也有研究表明，黃化突變體水稻光合能力顯著高于正常的野生型綠葉[10]。因此，光合能力的強弱不一定與突變體中光合色素含量高低呈正相關，不同葉色突變體所表現(xiàn)出的光合特性存在差異[11-13]。

彩葉楊(PopulusdeltoidsQuanhong)為楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)高大喬木，其葉片光鮮艷麗，且能迅速形成景觀效果，觀賞價值極高，園林應用前景良好。但在生產(chǎn)栽植中與野生型綠葉楊相比，彩葉楊生育期有所延遲，且生長勢較弱，目前尚未有造成二者生長差異具體原因的報道。因此，本研究以彩葉楊突變體中紅楊和全紅楊，以及野生型綠葉楊L2025為試驗材料，對其葉綠體超微結構和光合特性進行研究，探討芽變引起生長差異的具體原因，以期為彩葉楊在園林生產(chǎn)中的進一步推廣利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有材料均種植于成都平原四川農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代科研園區(qū)內(nèi)，其中中紅楊(Zhonghong poplar, ZHP)來源于野生型綠葉楊L2025的芽變，全紅楊(Quanhong poplar, QHP)來自于中紅楊芽變。栽種區(qū)為成都平原，屬亞熱帶季風氣候，年均溫18℃，年均降雨量約 1 000 mm，其栽培土壤理化性質為pH值5.8、有機質13.87 g·kg-1、全氮 0.65 g·kg-1、全磷0.31 g·kg-1、全鉀2.43 g·kg-1。選取3種長度約15 cm，直徑約 1 cm的均勻一致的楊樹插條，分別同時扦插在直徑37 cm的花盆中，每個花盆扦插一株，每材料扦插6盆，在四川農(nóng)業(yè)大學崇州基地林學院大棚中進行培養(yǎng)，水肥管理條件與常規(guī)一致。

1.2 試驗方法

1.2.1 株高、地徑和生物量的測定 在一年生扦插苗停止生長時，每種材料選6個單株測定其生長量。用卷尺測定各植株的株高，游標卡尺測地徑；將各植株分別用自來水充分沖洗后，再用去離子水洗凈，105℃殺青30 min，然后65℃烘至恒重，測定其干物質量。

1.2.2 色素含量的測定 葉綠素與類胡蘿卜素含量的測定參照張憲政[14]的方法。葉綠素與類胡蘿卜素用80%丙酮∶95%乙醇=2∶1混合液浸提，其含量用UV-2450紫外光分光光度計(日本Shimadzu公司)測定，設3次生物學重復。

葉片花色素苷含量的測定參照Ubi等[15]的方法，用1%鹽酸甲醇溶液浸提，采用紫外光分光光度計測定530 nm和657 nm處的吸光度值(OD)，并計算花青素含量，設3次生物學重復。

1.2.3 葉綠素代謝過程中間產(chǎn)物的測定 δ-氨基乙酰丙酸(δ-aminolevulinic acid，ALA)的提取及其含量測定參照王凌健等[16]的方法；膽色素原(porphobilinogen，PBG)、尿卟啉原Ⅲ(urogenⅢ)和糞卟啉原Ⅲ(coprogenⅢ)的測定參照Bogorad[17]的方法；原卟啉Ⅸ(protoⅨ)、原葉綠素酸酯(pchlide)和鎂原卟啉(Mg-Proto)含量測定參照Rebeiz等[18]的方法。測定結果采用相對定量的方法表示，即用紅葉楊測定計算結果相對于對照野生型綠葉楊L2025含量來表示葉綠素合成前體物含量。

1.2.4 光合作用測定 采用LI-6400便攜式光合系統(tǒng)(美國LI-COR公司)配以熒光葉室測定成熟葉片的凈光合速率。儀器參數(shù)按照萬雪琴等[19]的方法進行設置。

1.2.5 葉綠體超微結構的觀察 參照劉仁林等[20]的方法，利用H-600透射電鏡(日本Hitachi公司)進行葉綠體超微結構的觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Photosyn Assistant軟件擬合各植株的光響應曲線得出光飽和點、表光量子效率、呼吸速率、最大凈光合速率。采用SPSS 11.0對葉綠素代謝過程各中間產(chǎn)物含量與生長量及色素含量之間進行相關性分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 彩葉楊與綠葉楊L2025在葉色和生長方面的差異

突變體與野生型相比在生長勢上差異明顯，全紅楊的芽深紅色，萌芽后，葉片及嫩枝在3-6月為深紅色到紫色，7-9月轉變成淡紫色，10月以后至落葉前轉變成鮮紅色。中紅楊的芽紅色，萌芽后，葉片和嫩枝在3-6月表現(xiàn)為紅色，7-9月轉變成淡紅色，10月以后至落葉前有返綠現(xiàn)象，表現(xiàn)出半紅半綠。L2025的芽和枝條均為綠色，萌芽后，整個生長季節(jié)其葉片和枝條也均為綠色。由圖1可知，3種材料的一年生扦插苗長勢差異顯著，全紅楊的株高、地徑和干重分別較L2025顯著降低了45.4%、47.27%和50.7%，而中紅楊的株高、地徑和干重介于全紅楊和L2025之間。綜上，全紅楊的生長明顯弱于L2025，且二者差異顯著。

2.2 彩葉楊和綠葉楊L2025色素含量的差異

由圖2可知，全紅楊和中紅楊總葉綠素含量分別較L2025降低了35.8%和28.1%。其中，葉綠素a分別降低了38.3%和27.7%，葉綠素b分別降低了28.7%和29.3%。全紅楊和中紅楊的胡蘿卜素含量差異不大，分別較L2025降低了40.9%和33.1%。此外，全紅楊和中紅楊花青素含量分別是L2025的15.6倍和6.22倍。形態(tài)觀察表明，全紅楊的葉片呈深紫紅色，中紅楊的葉片呈紫紅偏綠色，L2025葉片完全呈綠色，這與其花青素的含量變化趨勢相符。

2.3 彩葉楊與綠葉楊L2025葉綠素合成中間代謝產(chǎn)物的變化

由圖3可知，全紅楊和中紅楊葉片中ALA、PBG、Urogen Ⅲ和Coprogen Ⅲ含量均顯著高于L2025，分別是L2025的655.2%、200.9%、344.8%、194%和314.4%、214.5%、495.1%、203.0%；而ProtoⅨ、Mg-Proto的含量顯著低于L2025，分別是L2025的85.4%、84.0%和66.7%、88.0%，全紅楊和中紅楊的Pchlide與L2025差異不顯著，分別為L2025的100.4%和96.6%。由此說明，2種紅葉楊葉綠素生物合成代謝可能受阻，受阻位點初步界定為CoprogenⅢ到ProtoⅨ之間，紅葉楊葉片葉綠素含量減少可能是葉綠素合成受阻導致的。

2.4 彩葉楊與綠葉楊L2025葉綠素合成中間代謝產(chǎn)物與色素含量、生長量之間的相關性

由表1可知，無論是野生型綠葉楊L2025還是突變體全紅楊和中紅楊，其葉綠素各中間代謝產(chǎn)物含量與葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素含量、株高、地徑及干重呈正相關關系，與花青素含量呈負相關。表明，楊樹植株的生長與光合色素合成代謝途徑中間產(chǎn)物含量密切相關。

注：不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。下同。Note:Different capital letters mean significant difference at 0.01 level. The same as following.圖1 彩葉楊與綠葉楊L2025一年生扦插苗株高、地徑及干重的差異Fig.1 The differences in height, ground diameter and dry weight of one-year old cuttings between color-leaved poplar and L2025 poplar

圖2 彩葉楊與綠葉楊L2025鮮葉片色素含量的差異Fig.2 The differences in pigment content in the fresh leaves between colar-leaved poplar and L2025 poplar

圖3 彩葉楊與綠葉楊L2025葉綠素合成前提物質相對含量的差異Fig.3 The differences of relative content of chlorophyll biosynthesis precursors between color-leaved poplar and L2025 poplar

表1 彩葉楊和綠葉楊L2025葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物含量與葉片色素含量、植株生長量之間的相關性比較Table 1 The differences of relative of intermediate metabolic products in chlorophyll biosynthesis, leaf pigment content and plant growth between color-leaved poplar and L2025 poplar

注：*表示在0.05水平上差異顯著。

Note:*indicates significant difference at 0.05 level.

2.5 彩葉楊與綠葉楊L2025光合作用的差異

由表2可知，芽變導致全紅楊和中紅楊植株的最大凈光合速率、光飽和點、表觀量子效率和呼吸速率顯著降低，而光補償點顯著增加。全紅楊和中紅楊的最大凈光合速率分別較L2025降低50.8%和18.5%，表明葉綠素合成代謝受阻，其葉綠素含量顯著降低，植物的光合作用減弱，進一步影響植株的生長，突變體全紅楊光合能力減弱是其生長緩慢的重要因素之一。

表2 彩葉楊和綠葉楊L2025光合作用的差異Table 2 The differences in photosynthetic characteristics between color-leaved poplar and L2025 poplar

注：同一列不同小寫字母表示在0.01水平差異顯著。

Note: Different lowercases in the same colum mean significant difference at 0.01 level.

注：Ⅰ、Ⅱ：L2025；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ：中紅楊；Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ：全紅楊。S：淀粉粒；O：嗜鋨顆粒；G：基粒片層。Note: Ⅰ、Ⅱ: L2025. Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ: Zhonghong poplar. Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ: Quanhong poplar. S: Starch grain. O: Osmiophilic granules. G: Grana lamella.圖4 彩葉楊和綠葉楊L2025的葉綠體超微結構 (×80000)Fig.4 Chloroplast ultrastructure between color-leaved poplar and L2025 poplar (×80 000)

2.6 彩葉楊和綠葉楊L2025葉綠體超微結構的差異

由圖4可知，突變體和野生型葉綠體超微結構差異較大。在綠葉楊L2025中，葉綠體呈長橢圓形，基粒類囊體豐富，片層結構發(fā)達，排列整齊，葉綠體緊貼細胞壁排列；含有嗜鋨顆粒和淀粉粒，其中淀粉粒多為1～2個，體積約占葉綠體總體積的二分之一(圖4-Ⅰ、Ⅱ)。中紅楊有基粒且排列整齊，但基粒片層明顯減少，葉綠體與細胞壁分開；淀粉粒個數(shù)減少為1，且體積增大，約占葉綠體總體積的三分之二，有的淀粉粒幾乎游離于葉綠體之外；含有嗜餓顆粒；葉肉細胞部分降解且出現(xiàn)呈空泡狀(圖4-Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。全紅楊葉綠體基粒片層結構松散，出現(xiàn)較大空隙，基質片層清晰可見，葉綠體與細胞壁間存在間隙；葉綠體形狀開始變得不規(guī)則；淀粉粒消失，嗜鋨顆粒增多；葉肉細胞呈現(xiàn)很多空泡狀，液泡中出現(xiàn)許多絮狀和粒狀物質(圖4-Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ)。

3 討論

研究表明，決定植物葉色的主要因子是葉片中的色素種類和含量，大多數(shù)常綠植物在整個生長季節(jié)里，其葉片主要的色素是葉綠素和類胡蘿卜素[21-22]。而大多數(shù)葉色突變是由于葉綠素缺乏或者葉綠體結構突變而改變了葉綠素和花青素的比例而導致葉色的改變。芽變引起的葉色突變(黃化、白化、紅色、超綠色等)在整個生長季節(jié)都呈現(xiàn)突變色[23-24]。本研究中突變體中紅楊和全紅楊的花青素含量顯著高于野生型L2025，而葉綠素含量顯著低于L2025，與前人研究結果一致。葉綠素含量減少可能是因為葉綠體結構的變化導致葉綠體功能的衰退，從而導致葉綠素合成受阻。擬南芥彩葉突變體的葉綠體超微結構改變導致葉綠素含量減少，而花青素相對含量升高，從而使擬南芥綠色突變?yōu)樽霞t色[25]；紅掌彩葉突變體的葉綠體畸形、葉綠素合成受阻[26]；文心蘭黃化突變體的葉綠體異常，基粒片層稀疏松散或缺失導致葉綠素合成受阻[27]。本研究也發(fā)現(xiàn)突變體中紅楊和全紅楊葉綠體基粒片層數(shù)減少、結構松散解體、淀粉粒減少、嗜鋨顆粒增多，從而影響了葉綠素的最終合成。本研究對葉綠素合成的中間產(chǎn)物進行了測定，結果表明全紅楊和中紅楊葉片中ALA、BPG、Urogen Ⅲ和CoprogenIII含量均顯著大于綠葉楊L2025，而ProtoⅨ和Mg-Proto、的含量顯著低于L2025。由此推測，2種紅葉楊葉綠素生物合成代謝可能受阻，其受阻位點可能位于CoprogenⅢ到ProtoⅨ之間的反應步驟，這與呂明等[28]的研究結果類似。文心蘭黃化突變體的葉綠素合成同樣在CoprogenⅢ 到ProtoⅨ的位點受阻[27]。不同突變體其葉綠素合成受阻位點可能存在差異，但均顯著影響葉綠素的合成[29-31]。

植物的生長與其光合能力密切相關，而光合作用的強弱不僅取決于光合色素(尤其是葉綠素a)的含量，還與光合電子傳遞效率密切相關。絕大多數(shù)研究表明，葉色突變體的光合能力明顯弱于野生型[32-33]。菊花黃葉突變體其天線系統(tǒng)中葉綠素的捕光效率下降，光合系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ, PSⅡ) 和光合系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ,PSⅠ) 電子傳遞受阻，從而降低其光合作用[34]。研究表明，彩葉楊突變體PS Ⅱ中負責光合電子傳遞的細胞色素復合體(cytochrome complex)以及鐵氧還原蛋白(ferredoxin, Fd)所對應的基因表達量下調(diào)，從而降低了電子傳遞效率[35]。與這些突變體類似，本研究中的突變體的光合能力較低，原因在于突變導致葉綠體超微結構改變，葉綠素合成受阻以及光合電子傳遞效率降低。本研究從理論上探討了芽變引起彩葉楊生長差異的具體原因，研究結果為彩葉楊在園林生產(chǎn)中的推廣繁殖方式提供了一定的參考依據(jù)。

4 結論

本研究結果表明，芽變引起葉綠體結構發(fā)生改變，葉綠素合成受阻，葉綠素和花青素的比例降低，從而導致葉色由綠色轉變?yōu)榧t色。此外，突變體光合色素(葉綠素和胡蘿卜素)含量降低，光合能力減弱，合成的有機物不能滿足自身生長的需求，從而導致突變體生長減弱。因此，建議彩葉楊(尤其是全紅楊)在四川地區(qū)的推廣可采用嫁接繁殖，這種方式既可以保持全紅楊的優(yōu)良性狀，又可以利用野生型綠葉楊L2025根系發(fā)達的特點來促進植株對水分和礦質吸收，促進全紅楊的生長。本研究從理論上證實了生產(chǎn)上全紅楊、中紅楊扦插生長慢的現(xiàn)象，為彩葉楊的推廣繁殖方式提供了一定參考依據(jù)。本試驗僅對葉色突變體及野生型的光合特性和葉綠體超微結構進行了研究，芽變的遺傳機制仍需進一步深入研究。