陶 鵬 趙彥婷 鐘新民 岳智臣 雷娟利 李必元

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

結球甘藍(Brassicaoleraceavar L.capitataL.)和菜心(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee)同屬十字花科蕓薹屬一年生或兩年生草本植物[1-2]。結球甘藍屬典型的綠體春化型植物，種子萌動階段不能感受低溫，待植株長到一定大小時(6片真葉以上)才能感受低溫，從而通過春化階段再抽薹開花[3]。而菜心由白菜易抽薹材料經(jīng)長期選擇和栽培馴化而來，具有周年抽薹的特性[2]，是利用嫁接促進結球甘藍抽薹開花的理想砧木材料。研究表明，結球甘藍與菜心相互嫁接具有良好的親和力，春季將結球甘藍嫁接到菜心的花序軸上，會促進接穗結球甘藍提早開花[4]。誘導植物抽薹開花主要有4條途徑，即春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑和自主途徑[5]，而嫁接可作為誘導植物開花的一條新途徑。

諸多研究表明嫁接可誘導嫁接體性狀發(fā)生改變，如程建徽等[6]通過主成分分析法發(fā)現(xiàn)，不同砧木會影響接穗歐亞種葡萄紅亞歷山大的產(chǎn)量和品質(zhì)；馬佩勇等[7]采用嫁接和短日照處理相結合的方法促進了甘薯開花結實。性狀變異是通過接穗與砧木之間的大量物質(zhì)運輸和相互作用實現(xiàn)的[8]。RNA大分子作為遺傳信息的攜帶者，可以通過嫁接連接處在接穗和砧木之間上下運輸[9-10]。如Huang等[11]通過擬南芥花序軸嫁接和RT-PCR(reverse transcription-PCR)分析，檢測到GAI基因的mRNA發(fā)生了長距離運輸；Kanehira等[12]在蘋果樹嫁接中發(fā)現(xiàn)，蘋果樹的IAA14基因的mRNA通過韌皮部從砧木運輸?shù)浇铀胫?；最新研究顯示具有tRNA類似結構的mRNA會富集在韌皮部，并穿過嫁接連接處向接穗中移動[13]。但植物的遺傳信息DNA在接穗和砧木之間是否也發(fā)生了運輸，目前尚未有相關研究報道。

研究表明擬南芥AtAGL24基因編碼了一種小分子量的MADS-box轉(zhuǎn)錄激活因子，其與AP1和SVP共同作用調(diào)控花分生組織的命運，促進頂端分生組織中花序的形成，并抑制花同源異型基因B、C、E類基因的表達[14-15]。在擬南芥和青花菜中均發(fā)現(xiàn)AGL24能與SOC1蛋白進行互作[16-17]。AGL24與SOC1蛋白共同調(diào)節(jié)赤霉素以影響開花，調(diào)控LFY基因的表達，促進提早開花[18-19]。AGL24與SOC1及FUL共同協(xié)作調(diào)控植物花期[20]。

本研究將結球甘藍G27作為接穗，分別嫁接到49菜心花序軸和結球甘藍G27莖上，取結球甘藍/結球甘藍嫁接體和結球甘藍/菜心嫁接體的接穗結球甘藍莖尖進行轉(zhuǎn)錄組測序分析?；诎撞撕徒Y球甘藍基因組數(shù)據(jù)[21-22]，拼接獲得菜心和結球甘藍AGL24基因的序列，基于種間差異序列在結球甘藍/菜心嫁接體的接穗結球甘藍莖尖中鑒定2條來自菜心的AGL24基因的mRNA read。比較分析同源嫁接體和異源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖中內(nèi)源BoAGL24基因的轉(zhuǎn)錄表達情況，以期從RNA運輸角度為嫁接誘導植物開花提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2016年8月17日和8月24日在浙江省農(nóng)業(yè)科學院玻璃溫室中，將結球甘藍G27和49菜心進行播種，生長至2016年10月3日時，將蓮座期的結球甘藍G27分別嫁接到已抽薹的49菜心花序軸上和蓮座期的結球甘藍G27莖上(對照組)。整個生長過程均在玻璃溫室中進行，不進行人工干預(如補光、溫度調(diào)控等)。嫁接后生長30 d，取結球甘藍/結球甘藍嫁接體的接穗結球甘藍莖尖(T1)和結球甘藍/菜心嫁接體的接穗結球甘藍莖尖(T2)(圖1)，莖尖長度約2 cm，重量約0.38 g，同時取實生苗菜心的葉片(T3)。RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序工作(測序材料為接穗結球甘藍莖尖)均由北京百邁客公司完成。

圖1 結球甘藍/結球甘藍同源嫁接體(左)和結球甘藍/菜心異源嫁接體(右)示意圖Fig.1 The diagram of head cabbage/head cabbage homograft (left) and head cabbage/Chinese flowering cabbage heterograft (right)

1.2 方法

1.2.1 菜心和結球甘藍AGL24序列拼接 以擬南芥AGL24基因(At4g24540)編碼序列作為檢索序列，在公共數(shù)據(jù)庫Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)和Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/Brassica_ oleracea/Info/Index)上進行檢索，獲得Bra019221和Bo7g109590共2個AGL24基因。記錄基因號及基因定位信息(詳見表1)。參考Bo7g109590序列，在同源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖的轉(zhuǎn)錄組測序文庫T1中檢索獲得AGL24基因的read，將這些read拼接成一條結球甘藍AGL24序列，并命名為BoAGL24；參考Bra019221序列，在實生苗菜心葉片的轉(zhuǎn)錄組測序文庫T3中篩選AGL24基因的read，再拼接獲得菜心AGL24序列，命名為BrAGL24。采用ExPASy在線軟件Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)預測AGL24蛋白質(zhì)分子量和等電點。

1.2.2 序列比對和系統(tǒng)樹分析 在公共數(shù)據(jù)庫Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/index.php)中進行檢索獲得十字花科植物12個物種的15個AGL24蛋白的氨基酸序列，利用ClustalX進行序列比對。再利用MEGA 5.2軟件，并采用鄰接(Neighbor-joining)法基于Jones-Taylor-Thornton模型構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap重復值設置為1 000次。

1.2.3 砧木菜心向接穗結球甘藍運輸?shù)腂rAGL24基因的mRNA read的鑒定 利用ClustalX將Bra019221、Bo7g109590、菜心BrAGL24基因及結球甘藍BoAGL24基因的編碼區(qū)序列進行比對?；诜N間差異序列的分布將其分成7個區(qū)塊，以菜心BrAGL24基因上相對應的序列命名為C1～C7，而結球甘藍BoAGL24基因上相對應的序列命名為G1～G7。以G1～G7作為檢索序列使用UltraEdit進行檢索，可用于比較在同源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T1和異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T2文庫中的結球甘藍內(nèi)源BoAGL24的轉(zhuǎn)錄表達情況。而以C1～C7作為檢索序列使用UltraEdit進行檢索，可在異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T2文庫中識別來自菜心的BrAGL24基因的mRNA read。

1.2.4 結球甘藍內(nèi)源BoAGL24基因的轉(zhuǎn)錄表達分析 利用BoAGL24基因上的G1～G7在T1和T2文庫進行檢索，可獲得內(nèi)源BoAGL24基因在同源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖T1和異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T2中的read數(shù)量。假設G1～G7每段序列作為獨立一個基因，再基于RPKM的計算方法計算假設的每個基因G1～G7的表達情況。計算方法為檢查到的read數(shù)除以map到基因組上的所有read數(shù)(以million為單位)與檢索序列長度(以kb為單位)。利用Mircrosoft Excel 2007軟件作圖，其中橫坐標為生物樣品，縱坐標為相對表達量(單位為RPKM)。使用Excel進行差異顯著性檢驗，并計算P值。

2 結果與分析

2.1 白菜和甘藍AGL24基因的鑒定與菜心和結球甘藍AGL24序列拼接

由于Bra013812僅有小部分序列與AtAGL24高度同源，大部分序列同源于At4g24530(OFUT31)，因此未對Bra013812進行分析，與其對應的甘藍中的直系同源基因Bo1g039080也未列入分析。由表1可知，AGL24基因編碼了一類分子量25 kDa左右的堿性轉(zhuǎn)錄因子(等電點8.35～9.14)。白菜和甘藍AGL24基因序列(Bra019221和Bo7g109590)均來自于白菜和甘藍全基因組公共數(shù)據(jù)庫。為了獲得本研究中49菜心和結球甘藍G27的AGL24基因序列，在實生苗菜心葉片的轉(zhuǎn)錄組測序文庫T3中，拼接獲得了菜心的BrAGL24基因編碼序列。同時，在結球甘藍/結球甘藍嫁接體的接穗結球甘藍莖尖的轉(zhuǎn)錄組測序文庫T1中，拼接獲得結球甘藍G27的BoAGL24基因編碼序列。BrAGL24和BoAGL24編碼的蛋白質(zhì)序列高度一致，BrAGL24和BoAGL24蛋白的等電點和分子量相近，為一類小分子量的堿性蛋白。

表1 不同物種AGL24基因相關信息分析Table 1 Related information of the AGL24 genes of different species

注：N/A：不適用。

Note: N/A: Not available.

2.2 十字花科植物AGL24蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

由圖2可知，所有蕓薹屬物種的AGL24之間親緣關系更近。其中，白菜(AA)的BrAGL24與甘藍型油菜(AACC)A基因組的BnaAGL24a、芥菜(AABB)A基因組的BjAGL24a聚成一支。黑芥(BB)的BniAGL24和來自芥菜(AABB)中B基因組的BjAGL24b聚成一支。甘藍(CC)的BoAGL24與來自甘藍型油菜(AACC)中C基因組的BnaAGL24b聚成一支。而AtAGL24、AlAGL24、CrAGL24a和CrAGL24a親緣關系更近。

2.3 菜心和結球甘藍BoAGL24基因的序列比對及種間差異序列的篩選。

由圖3可知，菜心BrAGL24和白菜Bra019221序列差異僅存在于終止密碼子附近的15個堿基。結球甘藍BoAGL24和Bo7g109590序列差異僅存在于起始密碼子附近。菜心和結球甘藍BoAGL24基因序列高度同源，但仍有少量堿基的差異。基于差異堿基的分布，這些種間差異序列分成7個區(qū)域(C1～C7)(表2)。這些序列將作為檢測砧木菜心BrAGL24的mRNA向接穗結球甘藍運輸?shù)臋z索序列。與C1～C7對應的結球甘藍的BoAGL24的種間差異序列命名為G1～G7(表3)，這些序列將作為分析接穗結球甘藍莖尖內(nèi)源BoAGL24轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的檢索序列。

2.4 菜心BrAGL24基因mRNA向接穗結球甘藍運輸?shù)膔ead的鑒定及其對轉(zhuǎn)錄組SNP的影響

由表2可知，C1～C7序列在結球甘藍/結球甘藍嫁接體的接穗結球甘藍莖尖T1文庫中均未檢索到。在結球甘藍/菜心嫁接體的結球甘藍莖尖T2文庫中進行檢索時，在C5、C6和C7各找到1個read，其中在C6和C7檢索到的read實際為同一個。

圖2 十字花科植物AGL24蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of AGL24 proteins from Brassicaceae species

表2 菜心BrAGL24基因中的種間差異序列及其在T1和T2中的數(shù)量Table 2 Interspecific differential sequence of BrAGL24 of Chinese flowering cabbage and the corresponding number in T1 and T2

注：黑體標記：差異堿基。

Note: Marked in bold:The differential base.

由圖4可知，結球甘藍內(nèi)源的AGL24 read序列與結球甘藍的BoAGL24的序列完全一致；而來自菜心的AGL24 read序列與實生苗菜心的BrAGL24的read序列高度同源，說明在C5、C6和C7鑒定出來的read是從砧木菜心中運輸?shù)浇铀虢Y球甘藍莖尖中的。以甘藍為參考基因組，基于轉(zhuǎn)錄組測序read分析結球甘藍莖尖AGL24的轉(zhuǎn)錄組SNP/Indel位點。由于砧木菜心的BrAGL24基因的mRNA運輸?shù)浇铀虢Y球甘藍莖尖T2中，在使用GATK軟件分析時，會增加T2中AGL24基因的轉(zhuǎn)錄組SNP/Indel位點。相比于T1中AGL24基因的轉(zhuǎn)錄組SNP/Indel位點數(shù)量，2條菜心的BrAGL24 mRNA read會增加T2中AGL24基因最多7個SNP位點和1個Indel位點。

2.5 結球甘藍內(nèi)源BoAGL24基因在同源嫁接體和異源嫁接體的接穗結球甘藍莖尖中的表達

使用G1-G7序列(與C1-C7序列相對應的，來自結球甘藍的BoAGL24基因的種間差異序列)分別在同源嫁接和異源嫁接的接穗結球甘藍莖尖T1和T2的轉(zhuǎn)錄組測序的Raw data中進行檢索，結果顯示G1～G7中所有的reads的絕對數(shù)量在T2中明顯多于在T1中的數(shù)量(表3)。

由圖5可知，G4序列中，T1中結球甘藍內(nèi)源BoAGL24基因轉(zhuǎn)錄表達量略高于T2中的轉(zhuǎn)錄表達量。而在其他的檢索序列中，T1中的BoAGL24內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄表達量均低于T2中的轉(zhuǎn)錄表達量?？傮w上，BoAGL24在異源嫁接體莖尖中的表達量要高于同源嫁接體莖尖中的表達量。差異顯著性分析結果顯示P值為0.032。

表3 結球甘藍BoAGL24基因中的種間差異序列及其在T1和T2中的數(shù)量Table 3 Interspecific differential sequence of BoAGL24 of head cabbage and the corresponding number in T1 and T2

圖3 白菜Bra019221和甘藍Bo7g109590的序列與結球甘藍BoAGL24和菜心BrAGL24序列比對Fig.3 The sequence of Bra019221 and Bo7g109590and sequence alignment with that of BoAGL24 and BrAGL24

圖4 結球甘藍/菜心嫁接體的接穗結球甘藍莖尖中結球甘藍內(nèi)源的BoAGL24 read和外源的菜心BrAGL24 read的序列比對Fig.4 In head cabbage/Chinese flowering cabbage grafting, sequence alignment of endogenous BoAGL24 reads and exogenous BrAGL24 reads from shoot apexes of scion of head cabbage

注： * 表示在0.05水平差異顯著。P值=0.032。Note: * indicate significant difference at 0.05 level. P value=0.032.圖5 結球甘藍BoAGL24基因的7種種間差異序列的相對表達量Fig.5 Relative expression of 7 interspecific differential sequence of the BoAGL24 gene of head cabbage

3 討論

菜心由白菜長期選擇馴化而來，具有常年抽薹的特征，主要通過自主途徑誘導抽薹開花[23]；而結球甘藍則需要在綠體階段通過春化才能誘導開花。因此，砧木菜心的易抽薹性狀可通過嫁接傳導到接穗結球甘藍中，并誘導接穗結球甘藍提早抽薹開花，而這種開花時間性狀的改變是通過接穗和砧木之間物質(zhì)的交流運輸來實現(xiàn)的[24]。作為遺傳信息載體的RNA(包括mRNA和小RNA)可在接穗和砧木中運輸[25-26]。研究表明嫁接中穗-砧mRNA的長距離運輸同時存在被動運輸和主動運輸2種方式[27]。Yang等[28]在青花菜的韌皮部汁液中通過PCR獲得了AGL24基因，證明青花菜AGL24的mRNA在韌皮部中是可移動的，進一步將野生型擬南芥作為接穗嫁接到P35S-AGL24和P35S-FVE的轉(zhuǎn)基因擬南芥上，結果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥砧木中的AGL24和FVEmRNA運輸?shù)揭吧蛿M南芥的接穗當中，并促進了接穗提前開花。本研究利用菜心BrAGL24的種間差異序列C1～C7在T1和T2文庫中進行檢索，在T2中檢索到來自菜心的BrAGL24的reads，而在對照組T1中卻不存在菜心BrAGL24的reads；序列比對結果顯示在結球甘藍莖尖轉(zhuǎn)錄組測序文庫T2中識別的菜心BrAGL24 read與菜心BrAGL24在序列上高度同源，說明T2文庫中的BrAGL24 read是從砧木菜心中運輸?shù)浇铀虢Y球甘藍的莖尖中的，與前人研究結果一致。

由于接穗和砧木之間存在RNA交流，結球甘藍/菜心異源嫁接體的接穗莖尖T2中會新增SNP/Indel位點。在結球甘藍/結球甘藍同源嫁接體中，由于接穗和砧木的mRNA均轉(zhuǎn)錄自結球甘藍基因組，mRNA序列是一致的，不會新增SNP/Indel位點。因此，比較同源嫁接體和異源嫁接體接穗莖尖的轉(zhuǎn)錄組SNP數(shù)量的變化，可用于評估砧木向接穗運輸?shù)膍RNA種類和數(shù)量。

研究表明，嫁接會誘導接穗相關基因的轉(zhuǎn)錄表達發(fā)生變化[29]，如王文嬌等[30]將黃瓜分別嫁接到黑籽南瓜和白籽南瓜上，發(fā)現(xiàn)在開花4 d后黑籽南瓜嫁接株的接穗黃瓜中5個蠟質(zhì)合成基因的轉(zhuǎn)錄表達量明顯高于白籽南瓜嫁接株和自根苗；Li等[31]發(fā)現(xiàn)，將黃瓜作為接穗嫁接到砧木南瓜上會導致嫁接體中miRNA及其靶基因的表達均發(fā)生改變。本研究除G4序列外，在其他的種間差異序列中內(nèi)源BoAGL24在T2中的轉(zhuǎn)錄表達水平均顯著高于T1。除嫁接外，光周期和溫度也是影響嫁接啟動接穗結球甘藍抽薹開花的關鍵因素，如在秋季進行結球甘藍/菜心異源嫁接，并不能促進接穗結球甘藍抽薹開花，而陶鵬等[4]研究發(fā)現(xiàn)在春季進行結球甘藍/菜心嫁接可以誘導接穗結球甘藍在嫁接后30～40 d開始形成花序，而對照組結球甘藍/結球甘藍嫁接則不會抽薹開花。

4 結論

本研究結果表明，菜心BrAGL24基因的mRNA在結球甘藍/菜心嫁接體中可以長距離運輸，進一步證實了十字花科植物中AGL24基因mRNA具有長距離運輸?shù)奶匦?。本研究為從RNA信號運輸角度研究結球甘藍/菜心嫁接誘導接穗抽薹開花的分子機制奠定了理論基礎。下一步可從AGL24基因的mRNA結構上進行深入研究，確定RNA結構與RNA長距離運輸?shù)年P系。