戴凱群 齊莉莉,* 王進(jìn)波 宋玉勝

(1 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2 寧波聚卿舫食品有限公司，浙江 寧波 315029)

楊梅[Myricarubra(Lour.) S. et Zucc. ]是我國(guó)江南特有水果，其風(fēng)味獨(dú)特，富含有機(jī)酸、氨基酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，還有豐富的多酚、花色苷、類黃酮等活性成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。研究表明，楊梅中的活性成分具有抗菌消炎[3-4]、抗氧化[5]、抑制腫瘤生長(zhǎng)[6-7]、防止DNA損傷[8]、控制肥胖[9]、調(diào)節(jié)機(jī)體糖和脂肪代謝[10-13]等多種生物學(xué)功能。

由于新鮮楊梅不易貯藏，故民間一直有用燒酒浸楊梅果的傳統(tǒng)，浸楊梅果后的燒酒稱為“楊梅酒”，其中的楊梅果則稱“酒浸楊梅”。《本草綱目》記載“楊梅味酸甜，性溫、無(wú)毒。能止渴、和五臟、滌腸胃，除煩潰惡氣”?！堕_(kāi)寶本草》記載，楊梅“主去痰、止嘔、斷下痢”。楊梅酒對(duì)腹瀉、痢疾等腸道疾病療效顯著，民間常用其止瀉。Yao等[14]用楊梅提取物飼喂模型小鼠，發(fā)現(xiàn)楊梅中的類黃酮能夠顯著抑制小鼠腹瀉。此外，楊梅酒對(duì)小鼠腹瀉也具有明顯的防治作用，其乙酸乙酯提取物和水提物均具有顯著的抑菌效果[15-16]。近年來(lái)抗生素的濫用使得細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了具有超強(qiáng)耐藥性的超級(jí)細(xì)菌，這給腹瀉、痢疾等感染性疾病的防控帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)[17-18]。若能通過(guò)研發(fā)楊梅酒活性成分開(kāi)發(fā)出抗生素藥物的替代品，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本研究首先對(duì)楊梅酒的體外抗菌效果進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，然后以不同溶劑萃取楊梅中的活性成分，結(jié)合小鼠體內(nèi)試驗(yàn)分析其抗菌效果，并利用Western Blotting、ELISA等技術(shù)探討楊梅酒活性提取物對(duì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路及炎癥因子表達(dá)的影響，以期闡釋楊梅酒防治腹瀉的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮楊梅購(gòu)自浙江慈溪農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；高粱燒(52% vol)購(gòu)自慈溪市和豐酒業(yè)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-8、TNF-α、NF-κB和β-actin等抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；丙烯酰胺凝膠儲(chǔ)液、Loading Buffer(6×)、硝酸纖維素薄膜(0.45 μm)等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、IL-8 酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技股份有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院腸道微生態(tài)與免疫實(shí)驗(yàn)室保存；Balb/C小鼠購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(浙)2014-0008]。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RV10DS96真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；Synergy H1全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；TE2000-S熒光倒置顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；G154DS型壓力蒸汽滅菌器，致微(廈門(mén))儀器有限公司；Chemidoc XRS凝膠成像儀、Turbo轉(zhuǎn)膜儀、Mini垂直板電泳儀，美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)儀器有限公司；Libra紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，英國(guó)柏楉有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 楊梅酒的制備 按照聶榮等[19]的方法并略作修改。楊梅果肉與高粱燒的比例為3∶5 g·mL-1，將楊梅果浸泡于高粱燒中，放置60 d后即得楊梅酒。

1.3.2 楊梅酒體外抑菌試驗(yàn) 采用生長(zhǎng)曲線法，將高粱燒或楊梅酒與經(jīng)滅菌的LB液體培養(yǎng)基按照體積比1∶9混合均勻。取上述混合好的LB液體培養(yǎng)基100 mL，分別加入5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌懸液，37℃恒溫?fù)u床(250 r·min-1)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、1.5、3、4、5、6、8、10、12 h取樣，測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，分析楊梅酒對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)、增殖的影響。

1.3.3 楊梅酒活性成分的分級(jí)提取 高粱燒浸泡楊梅用高速勻漿器搗碎，與楊梅酒一起旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙醇，然后5 000 r·min-1離心15 min，取適量上清液分別用等體積乙醚、乙酸乙酯連續(xù)萃取6 h，每種溶劑反復(fù)萃取3次，合并相同有機(jī)相萃取物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，即得萃取物。不同萃取劑提取的楊梅酒活性成分萃取物依次為無(wú)水乙醚相萃取物(ethyl ether extract, EEE)、乙酸乙酯萃取物(ethyl acetate extract, EACE)及水相提取物(water extract, WE)。

1.3.4 楊梅酒活性成分萃取物的體外抑菌試驗(yàn) 將3種分級(jí)提取物與雙蒸水按照5∶1 g·mL-1混合，采用管碟法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，以楊梅酒原液為對(duì)照，測(cè)定3種分級(jí)產(chǎn)物的抑菌活性。取200 μL菌液，均勻涂布于LB固體平板上，每個(gè)平板等距離放置3個(gè)滅菌牛津杯(內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm)，然后分別吸取3種分級(jí)提取物水溶液各200 μL加入牛津杯，每種提取物進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)，以無(wú)菌生理鹽水為陰性對(duì)照，卡那霉素(50 μg·mL-1)為陽(yáng)性對(duì)照。將牛津杯置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，量取抑菌圈直徑并記錄。

1.3.5 楊梅酒活性成分萃取物的動(dòng)物試驗(yàn) 選健康BALB/c小鼠，禁食12 h后，按照每10 g體重0.2 mL致病性大腸桿菌懸液(109CFU·mL-1)，施行腹腔注射，注射后觀察小鼠排便狀況，持續(xù)觀察6 h，小鼠每小時(shí)排稀便一次以上，則為腹瀉造模成功。試驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食。

選取造模成功的小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，雌雄各半，單只單籠飼養(yǎng)，籠內(nèi)墊有濾紙，每小時(shí)換一次。楊梅酒乙醚萃取物(EEE)、乙酸乙酯萃取物(EACE)、水相提取物(WE)與無(wú)菌水以5∶1 g·mL-1的比例混合。模型小鼠分別灌喂生理鹽水、楊梅酒、高粱燒、EEE、EACE及WE各2 mL·次-1，每隔2 h灌服1次，記錄各處理組小鼠灌服后6 h的腹瀉總次數(shù)。

1.3.6 HT-29細(xì)胞的處理 以HT-29細(xì)胞為腸道粘膜上皮細(xì)胞模型，在37℃、5%二氧化碳條件下，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。EACE溶解于RPMI-1640培養(yǎng)基中，得EACE濃度分別為0、1.0、5.0、10.0 mg·mL-1含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞瓶底面積70%時(shí)，細(xì)胞傳代、接種至六孔板上。待細(xì)胞長(zhǎng)至六孔板80%，用上述濃度梯度的培養(yǎng)基分別處理細(xì)胞12 h。

1.3.7 Western Blotting分析 HT-29細(xì)胞經(jīng)EACE處理培養(yǎng)12 h后，吸棄培養(yǎng)基，然后用生理鹽水洗滌細(xì)胞3次，提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度12.5%)分離蛋白質(zhì)條帶，然后100 V Turbo半干式轉(zhuǎn)膜2 h，再用TBS-T洗膜，室溫脫脂奶粉封閉2 h后進(jìn)行一抗(IL-8、TNF-α、NF-κB、β-actin)、二抗的孵育，膜上加入ECL顯色液，避光顯色5 min后放入化學(xué)發(fā)光儀中成像。采用BandScan 5.0軟件計(jì)算灰度值，目的蛋白與β-actin灰度比值即為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 ELISA分析 采用雙抗體夾心法，按照杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司提供的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)液上清液以300× g離心力離心10 min去除沉淀物，設(shè)為待測(cè)液。96孔板中每孔加入80 μL檢測(cè)緩沖液和20 μL待測(cè)液，然后每孔加入50 μL稀釋的檢測(cè)抗體，應(yīng)用封板膜封板，室溫下300 r·min-1振蕩孵育2 h。棄去前面加入的液體，每孔加入300 μL洗液洗板每次洗板，在吸水紙上拍干，洗滌6次；每孔加入100 μL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素并使用新的封板膜封板，然后室溫下300 r·min-1振蕩孵育45 min，再于每孔加入100 μL顯色底物，避光室溫孵育 5～30 min后每孔加入100 μL終止液，最后用全功能酶標(biāo)儀測(cè)定其雙波長(zhǎng)(450 nm和630 nm)下的吸光度值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2007 軟件和 SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用單因素ANOVA方差分析對(duì)不同劑量組間與對(duì)照組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅酒對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)增殖的影響

由圖1-A可知，與對(duì)照組(生理鹽水)相比，高粱燒對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)增殖幾乎沒(méi)有影響，而等量的楊梅酒則顯著抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)增殖(P<0.05)。由圖1-B可知，在處理3～5 h的楊梅酒和高粱燒均能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)增殖(P<0.05)，發(fā)揮抑菌作用；處理5 h后，楊梅酒仍具有較好的抑菌效果，而高粱燒則失去抑菌作用。由圖1-c可知，0～8 h內(nèi)，高粱燒能夠顯著抑制枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)增殖(P<0.05)，8 h后抑菌作用消失，細(xì)菌快速生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)橐掖急粨]發(fā)或消耗了；楊梅酒則能夠發(fā)揮持續(xù)抑菌作用，在8～12h其抑菌效果顯著好于高粱燒(P<0.05)。綜上表明，楊梅酒對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)增殖均具有明顯的抑制作用，其抑菌效果明顯好于等量的高粱燒，說(shuō)明楊梅酒的抑菌作用與楊梅中浸出的活性成分密切相關(guān)，而不僅是酒精發(fā)揮了抑菌作用。

2.2 楊梅酒活性成分萃取物的抑菌作用

由表1可知， EACE對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，且對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌活性明顯高于楊梅酒、WE和陽(yáng)性對(duì)照組。WE也對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性，其中，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性最強(qiáng)。但EEE對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等均無(wú)抑菌活性。綜上，EACE的抑菌活性最強(qiáng)，說(shuō)明乙酸乙酯對(duì)楊梅中抑菌活性成分的提取效率較高。

注：A、B、C分別表示大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A, B and C indicate E.coli, S.aureus, and B. subtilis, respectively. Different lowercase letters in the different graoups mean significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 楊梅酒對(duì)不同細(xì)菌生長(zhǎng)增殖的影響Fig.1 Effects of Chinese bayberry wine on the growth and proliferation of bacteria

表1 楊梅酒不同活性成分萃取物的抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle diameters of different extracts from Chinese bayberry wine /mm

注：同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；“ND”表示無(wú)抑菌圈。

Note: Different lowercase letters in the same line mean significant difference at 0.05 level. ‘ND’ means no antibacterial circle.

2.3 楊梅不同活性成分萃取物對(duì)小鼠腹瀉的防治作用

由圖2可知，灌胃、高粱燒、楊梅酒、WE和EACE的小鼠腹瀉狀況明顯緩解，而EEE對(duì)小鼠的腹瀉無(wú)明顯緩解作用，說(shuō)明楊梅乙酸乙酯萃取物EACE防治小鼠腹瀉的效果較好。

注：不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。Note: Different capital letters indicate extremely significant difference at 0.01 level. The same as following.圖2 楊梅不同活性萃取物對(duì)小鼠腹瀉次數(shù)的影響Fig.2 Effect of different active extracts from Chinese bayberry wine on the diarrhea times of mice

2.4 EACE對(duì)HT-29細(xì)胞炎癥因子表達(dá)與分泌水平的影響

由圖3可知，隨著EACE濃度的增加， IL-8、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平逐漸下降， NF-κB(p65)亞基的表達(dá)量也呈下降趨勢(shì)。ELISA分析結(jié)果與Western Blotting結(jié)果一致(圖4)，EACE處理能夠降低細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8、TNF-α等炎癥因子的水平，說(shuō)明楊梅活性萃取物EACE的成分可能通過(guò)抑制 NF-κB信號(hào)通路的激活，降低炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗腹瀉作用。

圖3 EACE對(duì)小鼠腹瀉炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of EACE on the expression of mouse diarrhea related inflammatory factors

圖4 EACE對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子濃度的影響Fig.4 Effect of EACE on the levels of inflammatory factors in the cell culture

3 討論

本研究結(jié)果表明，楊梅酒的抑菌效果明顯優(yōu)于高粱燒；楊梅酒能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)增殖，這與秦紅等[20]研究楊梅酒對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌等腸道菌抑制作用的結(jié)果一致。高粱燒等中國(guó)白酒含有多種活性成分，具有抑菌消炎作用[21]。本研究中，高粱燒浸泡楊梅所得楊梅酒的抑菌活性高于高粱燒，表明楊梅中的活性成分也發(fā)揮了抑菌作用。為了進(jìn)一步探究楊梅酒中的抑菌活性成分，本研究以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為代表菌株，比較楊梅酒乙酸乙酯萃取物(EACE)、水提物(WE)和乙醚萃取物(EEE)的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)EACE抑菌活性最高，WE次之，EEE幾乎無(wú)抑菌活性，這與Li等[3]的研究結(jié)果一致。楊梅酒活性萃取物的抑菌活性與其中的類黃酮、多酚等成分有關(guān)，萃取溶劑的性質(zhì)不同，其萃取物的組分就不相同，這些組分的抑菌能力存在很大差異，其預(yù)防和治療腸炎、腹瀉的效果也顯著不同。在體外抑菌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究以腹瀉小鼠為模型進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，結(jié)果表明，楊梅酒EACE和WE均具有治療小鼠腹瀉作用，而EEE對(duì)小鼠腹瀉無(wú)任何防治作用，這與Yao等[14]的研究結(jié)果一致。

NF-κB是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，由p50和p65兩個(gè)亞基組成。細(xì)胞受到炎癥信號(hào)刺激后，該因子的表達(dá)水平上升[22-24]，進(jìn)而上調(diào)其下游TNF-α、IL-8等促炎癥因子的表達(dá)，這些因子的表達(dá)和釋放能夠引起強(qiáng)烈的腸道炎癥反應(yīng)[25-27]。為深入解析楊梅酒防治腹瀉的機(jī)制，本研究以HT-29腸粘膜上皮細(xì)胞為模型，探究抑菌活性最強(qiáng)的EACE對(duì)TNF-α、IL-8表達(dá)和分泌的影響，發(fā)現(xiàn)EACE能夠顯著降低TNF-α和IL-8的水平，這與Guo等[28]發(fā)現(xiàn)楊梅提取物能夠降低人血液中TNF-α和IL-8水平的結(jié)果相似，表明楊梅中的活性物質(zhì)能夠通過(guò)抑制TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而防治腹瀉。本研究中，楊梅酒EACE能夠抑制p65亞基的表達(dá)，表明楊梅酒中的活性成分可能通過(guò)下調(diào) NF-κB信號(hào)通路，抑制TNF-α和IL-8等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮消炎、抗腹瀉作用。

4 結(jié)論

楊梅酒對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等腸道致病菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，其抑菌效果好于高粱燒；楊梅酒能夠顯著降低腹瀉模型小鼠腹瀉次數(shù)，明顯防治小鼠腹瀉。楊梅酒乙酸乙酯萃取物(EACE)抑菌活性最高，水提物(WE)次之，乙醚提取物(EEE)則無(wú)抑菌作用。楊梅EACE具有很強(qiáng)的防治小鼠腹瀉的作用，其效果優(yōu)于楊梅酒和高粱燒；楊梅酒EACE可通過(guò)抑制腸道NF-κB信號(hào)通路的活性，降低腸道上皮細(xì)胞TNF-α、IL-8等炎癥因子的表達(dá)水平，從而發(fā)揮生理活性作用。今后可利用色譜分離、質(zhì)譜鑒定等方法對(duì)楊梅EACE的組分進(jìn)行分離、鑒定并解析其結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步明確楊梅酒中EACE的防治腹瀉的活性物質(zhì)成分。