朱蕾，張愛靜，王鵬杰，李琳瓊，高瑀瓏

（南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

假單胞菌是一種能在低溫下生長的食品腐敗菌，極易污染肉制品、乳制品和蔬菜等食品并引起腐敗變質(zhì)。因此，該菌是引起食品腐敗變質(zhì)的重要微生物[1]。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌中最常見的一個種，又稱綠膿桿菌，廣泛分布于水、空氣、土壤以及人體的呼吸道、皮膚和腸道等處，尤其在潮濕的自然環(huán)境中更易生長繁殖，所以其傳播途徑廣泛[2]，該菌是一種條件性致病菌，可引起人類急性腸道炎、皮膚炎、敗血病和腦膜炎等疾病，其產(chǎn)生的內(nèi)、外毒素具有致病性，內(nèi)毒素能引起系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory responsible syndrome，SIRS），對于老人、小孩等抵抗力較弱的群體危害較大，其外毒素侵入敏感細胞后，引起哺乳動物蛋白合成受阻，臨床上常引起繼發(fā)性感染[3-4]。2014年之前，在食品衛(wèi)生監(jiān)測工作中對其監(jiān)控較少，與食物中毒相關(guān)的報道較少，但由于其對抗生素等化學(xué)治療劑有較強的抵抗性[5]，分布廣，在食品中污染機會較多，有報道建議將銅綠假單胞菌列入食物中毒致病菌的目錄中[6]。2003年黃美子等[7]報道了食用新鮮豬肉后出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀的案例，經(jīng)衛(wèi)生防疫鑒定是由銅綠假單胞菌引起的。2010年沈瑛等[8]也報道出銅綠假單胞菌引起食物中毒的事件。2014年我國對瓶裝飲用水等衛(wèi)生檢測進行了修訂，增加對銅綠假單胞菌的監(jiān)測檢驗，將其確認為食源性和水源性致病菌。隨著人們對食品安全的重視，食品微生物安全預(yù)測是人們目前關(guān)注的熱點[9]。食品微生物預(yù)測學(xué)是一門基于微生物學(xué)、應(yīng)用計算機學(xué)、工程數(shù)學(xué)及統(tǒng)計學(xué)等的綜合學(xué)科。微生物預(yù)測模型的建立有利于食品在貯藏、運輸和銷售等期間內(nèi)微生物變化的監(jiān)測，了解其存活信息[10]，為食品的微生物安全控制提供科學(xué)理論依據(jù)[11]。微生物生長預(yù)測模型主要有一級模型、二級模型。一級模型是描述微生物數(shù)量對時間的函數(shù)，常見的一級模型有Linear模型、Logistic[12]模型和Gompertz[13]模型等。Linear模型的操作簡便，但預(yù)測的精確度不高；Logistic模型在數(shù)學(xué)上是用于描述一個普通笛卡爾平面上的S形曲線，有人將其用于研究細菌生長曲線，但其不能完整顯示S形曲線，是一個無遲滯期的S形曲線[12]，而Gompertz模型克服了這些缺點，目前應(yīng)用較多[9]。Gompertz模型能夠較好地用于研究單細胞微生物的生長曲線，在研究細菌生長的遲滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期時，分別用遲滯時間（λ）、最大比生長速率（μmax）、最大菌落數(shù)（b）來描述這3個階段的特征。在食品儲藏期間，λ可用于分析食品貨架期的參數(shù)，表示食品安全儲存時間的長短；μmax是微生物生長動力學(xué)參數(shù)，表示食品腐敗變質(zhì)的速率；b表示在腐敗變質(zhì)的食品中，微生物的最大生長量。目前國內(nèi)外對一些食品基質(zhì)中微生物生長模型的建立已有一些報道，但是對于銅綠假單胞菌預(yù)測模型的研究鮮有報道。鄒宇等[14]運用Gompertz模型、Logistic模型建立了在低溫下李斯特氏菌的生長模型，發(fā)現(xiàn)Gompertz模型為李斯特氏菌在牛奶中生長的最適模型；M?ller等[15]在新鮮牛肉中建立了沙門氏菌的生長模型；Yong[13]等用Gompertz和Logistic模型擬合了生豬肉中李斯特氏菌的生長曲線。目前用來研究微生物生長常用的二級模型有Ratkowsky[16]模型、Square Root[17]平方根模型、二次多項數(shù)學(xué)模型[18]、Arrhenius模型[9，19]。Square Root模型沒有生物學(xué)基礎(chǔ)，是基于觀察，認為微生物最大比生長速率的平方根與生長溫度成線性關(guān)系；二次多項數(shù)學(xué)模型是研究多種因素對微生物的生長的影響，其中的參數(shù)也沒有明確的物理意義；Arrhenius模型最初是用來表征化學(xué)反應(yīng)中反應(yīng)速率與溫度之間的關(guān)系，有人也曾用此模型來預(yù)測微生物的生長，因誤差較大，目前應(yīng)用較少。研究溫度對微生物生長速率的影響，常采用Ratkowsky模型。目前對于新增的食源致病性銅綠假單胞菌安全預(yù)測的研究國內(nèi)外鮮見報道。本研究旨在以食源致病性銅綠假單胞菌為研究對象，為預(yù)測其安全性，本研究基于Gompertz模型、Ratkowsky模型、Hyperbola[20]模型研究銅綠假單胞菌從6℃到48℃的生長；研究生長溫度對銅綠假單胞菌最大比生長速率μmax與遲滯時間λ的影響；將μmax與λ的乘積定義為菌體細胞的生理狀態(tài)參數(shù)h0，研究生長溫度對菌體h0的影響。建立銅綠假單胞菌生長的預(yù)測一級模型；建立生長溫度對最大比生長速率μmax、遲滯時間λ影響的預(yù)測二級模型，為其在食品中的安全控制奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853：北京微生物研究所，采用胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入TSB液體培養(yǎng)基，于37℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

1.2 主要儀器與試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）：南京丁貝生物科技有限公司。

BSC-1300ⅡA2型生物安全柜：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Scan1200型自動影像分析菌落計數(shù)儀：法國Intersicence公司；ZQTY-70S型大容量低溫搖床：上海知楚儀器有限公司；HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設(shè)備廠；101-3AS電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海蘇進儀器設(shè)備廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；Sartorious精密電子天平：北京塞多斯天平有限公司；BCD-196T型冰箱：青島海爾股份有限公司；微生物試驗常規(guī)儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度的生長及平板菌落計數(shù)

將1.1節(jié)制備的ATCC27853菌懸液接種于TSB培養(yǎng)基中，然后分別置于6、10、16、22、28、36、42、45、48、50℃下，140 r/min振蕩培養(yǎng)，每個溫度在不同時間點進行取樣并菌落計數(shù)，不同的培養(yǎng)溫度選取不同的時間間隔取樣并在TSA平板上進行菌落計數(shù)。按文獻[21]方法進行菌落記數(shù)。ATCC27853的生長量的表達：計算每毫升培養(yǎng)基中活菌的數(shù)量（CFU/mL），然后用以10為底的對數(shù)來表示lg（CFU/mL）。

1.3.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長的一級Gompertz模型的建立

本研究利用Gompertz模型來擬合ATCC27853在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃的溫度下的生長曲線，建立ATCC27853在不同溫度下生長的一級模型，Gompertz模型見（1）式

式中：Nt為在某時間t，ATCC27853菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；a為（時間t=0時）ATCC27853初始菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；b為ATCC27853最大菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；c為ATCC27853在d時刻的最大生長速率，h-1；d為達到最大生長速率時所用的時間，即生長曲線的拐點，h。

細菌的最大比生長速率μmax和遲滯時間λ是用來描述其生長的兩個關(guān)鍵參數(shù)。ATCC27853的μmax、λ與Gompertz模型的相關(guān)參數(shù)之間的關(guān)系[22]分別見（2）和（3）式

式中：μmax為ATCC27853的最大比生長速率，h-1；a為（時間t=0時）ATCC27853初始菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；b為ATCC27853最大菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；c為ATCC27853在d時刻的最大生長速率，h-1；e為自然常數(shù)，等于2.718 28。

式中：λ為ATCC27853的遲滯時間，h；c為在d時刻的最大生長速率，h-1；d表示達到最大生長速率時所用的時間，即生長曲線的拐點，h。

將（2）、（3）式代入（1）式中，則Gompertz模型可轉(zhuǎn)化為（4）式

式中：Nt表示某時間t，ATCC27853每毫升菌懸液中菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；N0為時間t為0時，ATCC 27853每毫升菌懸液中初始菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；Nmax為ATCC27853最大菌數(shù)的對數(shù)，lg（CFU/mL）；λ 為ATCC27853的遲滯時間，h；μmax為最大比生長速率，h-1；e為自然常數(shù)，等于2.718 28。

微生物生長的遲滯期是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后，因代謝系統(tǒng)適應(yīng)新環(huán)境的需要，RNA含量增加，核糖體、酶類和ATP等內(nèi)含物的合成加速，新的細胞成分被合成，細胞形態(tài)和體積變大，但這一階段細胞數(shù)目沒有增加。本研究中，我們將這一階段的這種生理、代謝狀態(tài)稱之為細胞的生理狀態(tài)，用參數(shù)h0來表示[13]，用來描述細胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，h0與遲滯時間λ和最大比生長速率μmax的關(guān)系[23]見（5）式

式中：h0為細胞生理狀態(tài)參數(shù)；μmax為最大比生長速率，h-1；λ 為ATCC27853 的遲滯時間，h。

1.3.3 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長的二級Ratkowsky 和Hyperbola 模型的建立

在一級模型的基礎(chǔ)上建立的二級模型，研究生長溫度對一級模型參數(shù)的影響。利用Ratkowsky 模型，研究最大比生長速率與溫度的關(guān)系，見（6）式

式中：μmax為在溫度T 下的最大比生長速率，h-1；Tmin為ATCC27853 生長代謝活力為零時的最低溫度，℃；Tmax為ATCC27853 生長代謝活力為零時的最高溫度，℃；m、n 為常數(shù)，單位分別為℃-1h-0.5和℃-1。

基于Hyperbola 模型，將ATCC27853 遲滯時間λ取自然對數(shù)轉(zhuǎn)化成ln（λ），研究遲滯時間和溫度之間的關(guān)系，見（7）式

式中：λ 為ATCC27853 生長的遲滯時間，h；q 為微生物的最低生長溫度，℃；p 為當(dāng)生長溫度大于最低生長溫度時，遲滯時間減少所對應(yīng)的溫度的升高量，℃。

1.3.4 模型的評價及其驗證

采用MATLAB 2016b 軟件對試驗數(shù)據(jù)分別進行Gompertz、Ratkowsky 和Hyperbola 模型的建立。模型的評價采用決定系數(shù)R2、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、準確因子Af和偏差因子Bf。其中，R2和RMSE 表示模型的精確度、可靠性，R2越接近于1，RMSE 越小，模型擬合度越高；Af用于衡量預(yù)測值與觀測值之間的接近程度[24-25]，Af越接近于1 模型的擬合越好，Af值越小，表明模型預(yù)測值與實測值越接近，模型越精確；Bf〉1 表示模型預(yù)測值比實測值高，當(dāng)Bf〈1表示模型預(yù)測值比實測值低，Bf越接近1，模型擬合度也越高[26]。

模型的驗證采用決定系數(shù)R2、準確因子Af和偏差因子Bf。一級模型的驗證，在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃的溫度下生長，每個生長溫度取不同于模型建立的時間點進行取樣驗證。二級模型的驗證，設(shè)置不同的生長溫度12、19、25、39、44℃進行取樣驗證，每次試驗重復(fù)3 次；相關(guān)計算見（8）、（9）和（10）式

式中：n 表示測定值的個數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長的一級Gompertz模型的建立

ATCC27853 在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃下生長的Gompertz 模型曲線和50℃的失活情況見圖1。

圖1 銅綠假單胞菌ATCC27853 在6、10、16、22、28、36、42、45、48℃下生長的Gompertz 一級模型曲線以及50℃的失活情況Fig.1 Growth curves of Gompertz primary model for P.aeruginosa ATCC27853 under the temperatures of 6，10，16，22，28，36，42，45，48℃and inactivation at 50℃

由圖1可以看出，除50℃外，其余溫度的實測值皆比較均勻地分布于預(yù)測生長曲線的兩側(cè)，說明利用Gompertz 模型能較好地擬合ATCC27853 從6℃～48℃的生長曲線，從低到高這9個溫度下ATCC27853 的生長曲線基本均呈現(xiàn)“S”型，有遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期三部分。對于遲滯期，在低溫度下，遲滯期較為明顯，如，在10℃下，遲滯時間約為30 h，當(dāng)生長溫度超過28℃后，遲滯期就變得很短，如，在28、36、42℃下僅用2個多小時就能進入對數(shù)生長期，菌體能很快適應(yīng)新的環(huán)境；進入對數(shù)期后，不同生長溫度的對數(shù)期差異顯著（P〈0.05），如6℃的對數(shù)期約400 h，而36℃的只需約10 h，表明ATCC27853 在不同溫度下的生長速度不同；進入穩(wěn)定期后，在10℃～42℃下，菌體最大生長量為9.22 lg（CFU/mL）～9.39 lg（CFU/mL），差異不顯著（P 〉0.05）；在6、45、48℃下的菌體最大生長量顯著降低（P〈0.05）。ATCC27853 在50℃隨著時間的延長，菌數(shù)在降低，11 h 后，檢測不到菌體數(shù)，說明ATCC27853在50℃下不生長，已經(jīng)失活。綜上看來，生長溫度是ATCC27853 生長繁殖的關(guān)鍵因素。

ATCC27853 從6℃到48℃下9個生長溫度的Gompertz 模型的初始濃度（initial bacteria counts，IBC）a、最大菌落數(shù)（maximum bacteria counts，MBC）b、最大生長速率（maximum growth rate，MGR）c、拐點（turning point，TP）d、最大比生長速率（maximum specific growth rate，MSGR）μmax、遲滯時間（lag phase duration，LPD）λ和生理狀態(tài)參數(shù)（physiological state parameter，PSP）h0等參數(shù)的估計值見表1。

由表1可以看出，9個溫度下，菌體初始濃度a 在2.53 lg（CFU/mL）～3.53 lg（CFU/mL）之間，彼此相差小于1個lg（CFU/mL）。在16℃～45℃下生長，ATCC27853菌體生長最大濃度均可達到109（CFU/mL），表明在16℃～45℃，ATCC27853 生長所能達到最大濃度并不隨溫度的變化而變化。當(dāng)溫度為6、10、48℃時，ATCC27853 生長最大濃度分別為7.24、8.68、7.09 lg（CFU/mL），與16℃～45℃相比，差異顯著（P〈0.05），菌體的生長受到明顯的抑制。從6℃到48℃，最大生長速率c 隨溫度的增大先增大后減小，36℃時c 值最大；拐點d 隨溫度的增大呈先下降再上升的趨勢，從197.57 h 減小到5.95 h 再增大到27.42 h，36℃時d 值最小。

表1 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下生長的Gompertz 一級模型參數(shù)值Table 1 The estimated vales for parameters in the growth curves of Gompertz primary model for P.aeruginosa ATCC27853 under the different temperatures

在6℃～36℃的生長溫度范圍內(nèi)，μmax由0.015 5增長到0.571 5，因為隨著溫度的升高，ATCC27853 的代謝反應(yīng)及生長速率在加快，最適生長溫度36℃也是該菌生長速率最高的溫度；當(dāng)生長溫度為48℃時，生長速率顯著降低到0.162 7（P 〈 0.05），生長溫度上升到50℃時，可能是因為ATCC27853 體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、細胞膜等熱敏感性大分子物質(zhì)在高溫下發(fā)生變性，細胞的生理代謝功能急劇下降，菌體死亡；對應(yīng)的遲滯期也發(fā)生相應(yīng)的變化，從107.51 h 降到1.95 h，之后又升到17.11 h，ATCC27853 在最適生長溫度36℃時，遲滯期最短。在食品儲藏期間，一旦由微生物引起腐敗變質(zhì)，微生物的遲滯期與其貨架期有關(guān)，遲滯期越長貨架期越長，在較低溫和較高溫的情況下，遲滯期較長，會延長食品的貨價期。h0代表ATCC27853 細胞的生理狀態(tài)參數(shù)，描述細胞適應(yīng)新環(huán)境的能力，生理狀態(tài)參數(shù)h0越高，細胞適應(yīng)環(huán)境的能力越弱，由表1可以看出溫度為6℃和48℃時的生理狀態(tài)參數(shù)h0比較高，10℃～45℃時，生理狀態(tài)參數(shù)基本保持不變，差異不顯著（P〉0.05）。此外，50℃與6℃～48℃菌體的初始濃度基本相同，50℃下，隨著培養(yǎng)時間的延長，ATCC27853 菌體細胞不能忍受此高溫，其數(shù)量呈下降趨勢，并于11 h 后檢測不到菌體數(shù)，表明ATCC27853菌體死亡。

2.2 銅綠假單胞菌ATCC27853在不同溫度下一級Gompertz生長模型的評價

ATCC27853 在不同溫度下生長的一級Gompertz擬合模型的評價結(jié)果見表2。

表2 銅綠假單胞菌ATCC27853 不同溫度下生長的Gompertz 擬合模型的評價結(jié)果Table 2 Fitting evaluation of Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853 growth under different temperatures

續(xù)表2 銅綠假單胞菌ATCC27853 不同溫度下生長的Gompertz擬合模型的評價結(jié)果Continue table 2 Fitting evaluation of Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853 growth under different temperatures

由表2可知，在6℃～48℃，模型的RMSE≤0.191 6，R2≥0.9956，說明模型擬合效果較好。本研究中Af和Bf皆比較接近于1，也表明該模型的擬合度好，ATCC27853 的一級Gompertz 生長模型的預(yù)測值與實測值之間偏差很小，沒有系統(tǒng)偏差，不會產(chǎn)生“failsafe”的情況。Ross 等[27]研究認為，Bf在0.90～1.05 的范圍內(nèi)，模型擬合好；Bf在0.70～0.90 與1.06～1.15 之間模型擬合效果可以接受；Bf〈0.70 或Bf〉1.15，存在系統(tǒng)偏差，模型擬合不可接受。綜上分析，本研究建立的一級Gompertz 模型能很好的預(yù)測ATCC27853 從6℃到48℃溫度下的生長，擬合效果好，且有效、可靠。

2.3 銅綠假單胞菌ATCC27853一級Gompertz生長模型的驗證

ATCC27853 在不同溫度下生長的一級Gompertz擬合模型的驗證結(jié)果見表3。

表3 銅綠假單胞菌ATCC27853Gompertz 模型的驗證Table 3 Validation of the Gompertz model for P.aeruginosa ATCC27853

利用Matlab 軟件對表3中實測值及一級模型的預(yù)測值進行相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2=0.989 0，Af=1.047 9，Bf=0.998 2，也表明Gompertz 模型的合適性及有效性，可以利用Gompertz 模型對ATCC27853 生長進行預(yù)測。

2.4 銅綠假單胞菌ATCC27853二級模型的建立

為了進一步了解溫度對ATCC27853 生長速率的影響，基于2.1 節(jié)建立的一級Gompertz 模型，利用Ratkowsky 模型來研究生長溫度對最大比生長速率μmax的影響，見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌ATCC27853 生長溫度對最大比生長速率的影響Fig.2 The effect of the growth temperatures on maximum specific growth rate for P.aeruginosa ATCC27853

由圖2可知，隨著溫度的升高，ATCC27853 的μmax逐漸增加，直至最適生長溫度36℃，當(dāng)溫度超過36℃后，μmax開始下降，直至為零。微生物生長的遲滯期是指微生物接種到新鮮培養(yǎng)液后，要適應(yīng)新環(huán)境，一時還缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或者足夠的中間代謝物，其細胞數(shù)目不會發(fā)生變化，不過在不同的生長溫度下這個適應(yīng)期是不相同的。本研究中，ATCC27853的遲滯時間為λ，λ 的自然對數(shù)ln（λ）與溫度之間的關(guān)系見圖3。

由圖3可知，ATCC27853 隨生長溫度的升高，遲滯期λ 逐漸減小，ln（λ）降低，說明隨著生長溫度的升高，ATCC27853 細胞的代謝系統(tǒng)適應(yīng)溫度變化的時間在變短。但是，當(dāng)溫度升到48℃后，遲滯期顯著增大（P〈0.05），Hyperbola 模型不再適宜擬合生長溫度與ln（λ）的關(guān)系。

ATCC27853 二級模型的參數(shù)的估計值見表4。

表4 二級模型參數(shù)的估計值和95%置信區(qū)間值Table 4 Estimates and 95%confidence level of parameters for the secondary models

ATCC27853 最大比生長速率Ratkowsky 模型的參數(shù)表明，理論上其最低生長溫度Tmin為5.6℃；最高生長溫度Tmax為49.3℃，本研究所建立的具有最低生長溫度和最高生長溫度的ATCC27853 的生長速率模型，為其在食品中的安全控制提供理論依據(jù)。ATCC27853遲滯期的Hyperbola 模型中，q 為1.7℃，是ATCC27853生長最低溫度；參數(shù)Tmin和q 皆表示理論最低生長溫度，試驗表明ATCC27853 在4℃下基本不生長（試驗數(shù)據(jù)未顯示），Ratkowsky 模型中最低溫度的理論值與實際值更接近，同時利用Hyperbola 模型能夠快速地預(yù)測食品的安全儲存時間，確定其貨架期。

2.5 銅綠假單胞菌ATCC27853二級模型的評價

ATCC27853 在不同溫度下生長的Ratkowsky 和Hyperbola 二級模型的評價結(jié)果見表5。

表5 二級模型擬合結(jié)果的評價Table 5 Fitting evaluation of the secondary models

由表5可知，RMSE≤0.151 3，R2≥0.978 3，1.157 9≤Af≤1.207 8，0.986 2 ≤Bf≤1.017 6，R2、Af和Bf皆接近于1，可以說明二級模型擬合度較好。

2.6 銅綠假單胞菌ATCC27853二級模型的驗證

ATCC27853 在不同溫度下生長的二級模型的驗證結(jié)果見表6。

利用Matlab 軟件將試驗所得最大比生長速率的實測值與Ratkowsky 模型的預(yù)測值進行相關(guān)性分析，決定系數(shù)R2=0.995 2，Af=1.090 4，Bf=0.966 4；遲滯時間自然對數(shù)的實測值與Hyperbola 模型預(yù)測值的相關(guān)性分析，R2=0.975 9，Af=1.077 7，Bf=0.997 0。表明本研究所建立的Ratkowsky 和Hyperbola 二級模型是有效和可靠的。

表6 銅綠假單胞菌ATCC27853二級模型的驗證結(jié)果Table 6 Validation of the secondary models for P.aeruginosa ATCC27853

3 討論

銅綠假單胞菌ATCC27853 是一種條件性致病菌，極易污染食品。本研究建立了從6℃到48℃下ATCC27853 生長的一級和二級模型，發(fā)現(xiàn)ATCC27853能在6℃低溫下生長，最高生長溫度為48℃；研究了溫度對ATCC27853 生長的影響及其預(yù)測，為其在食品中的安全控制奠定理論依據(jù)。

本研究首先利用 Gompertz 模型建立了ATCC27853 的一級生長模型，基于一級生長模型的參數(shù)，再結(jié)合Ratkowsky 與Hyperbola 模型分別建立了ATCC27853 的最大比生長速率μmax、遲滯時間λ 與生長溫度之間的二級模型。本研究發(fā)現(xiàn)Ratkowsky 與Hyperbola 模型能分別較好地建立ATCC27853 生長溫度與最大比生長速率、生長溫度與遲滯時間的關(guān)系。

由參數(shù)h0可以確定ATCC27853 的生理狀態(tài)[25]。Baranyi 和Roberts 等[28]、Gospavic 等[23]和Velugoti 等[29]研究認為不同溫度下菌體細胞的生理狀態(tài)參數(shù)基本保持恒定。Mellefont 等[30]在研究生長溫度對大腸桿菌和克雷伯氏菌的影響時，發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)參數(shù)h0不是恒定不變的，溫度的變化還會影響遲滯期；Delignette-Muller 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特氏菌接種前的培養(yǎng)溫度與接種后的生長溫度的變化幅度與h0有一定的相關(guān)性；Xanthiakos 等[25]研究了1.5℃～16℃下單增李斯特菌的生長，發(fā)現(xiàn)在1.5℃～8℃下生理狀態(tài)參數(shù)h0明顯高于在8℃～16℃生長的h0。

在ATCC27853 的初始菌濃度基本相同的情況下，本研究發(fā)現(xiàn)在10℃～45℃的范圍內(nèi)，生理狀態(tài)參數(shù)h0基本保持恒定，隨溫度變化，h0變化不顯著（P〉0.05），這與Gospavic 等[23]的研究結(jié)果相一致；但在6℃時，h0明顯高于10℃～45℃的h0，此結(jié)果與Xanthiakos[25]的研究結(jié)果相一致，原因可能是低溫6℃限制了菌體細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和細胞膜等大分子物質(zhì)的合成。

Baranyi 和Roberts[28]的研究認為h0=μmax× λ，α0=exp（-h0）。當(dāng)ATCC27853 的生長溫度10℃時，h0=0.889 0，則 α0=41.1%，表明在此溫度下，ATCC27853菌體細胞的生長速率為最大比生長速率的41.1%；在10℃～45℃時 α0的平均值約為34.8%，6、48℃時 α0分別為18.9%和6.2%，可以看出6、48℃的α0明顯低于10℃～45℃，生長溫度為6℃和48℃比生長速率明顯較低，推測可能是ATCC27853 接種前的培養(yǎng)溫度（36℃）與接種后的生長溫度（6、48℃）之間存在較大的差異導(dǎo)致生理狀態(tài)較大的改變，生長溫度對生理狀態(tài)的影響為預(yù)測微生物生長研究提供重要的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用Gompertz 模型建立了6℃～48℃下銅綠假單胞菌ATCC27853 的一級生長模型，結(jié)合Ratkowsky 與Hyperbola 模型分別建立了ATCC27853的生長溫度對其μmax和λ 影響的二級模型；用決定系數(shù)R2、均方根誤差RMSE、準確因子Af和偏差因子Bf評價模型擬合優(yōu)度并驗證了模型的有效性和可靠性，結(jié)果表明用Gompertz、Ratkowsky 與Hyperbola 模型建立的一級生長模型和二級模型擬合度高；ATCC27853的生長溫度對生理狀態(tài)參數(shù)h0的影響表明接種前的培養(yǎng)溫度（36℃）與被接種后的生長溫度（6℃及48℃）之間存在較大的差異會導(dǎo)致生理狀態(tài)參數(shù)發(fā)生較大的改變。ATCC27853 的生長溫度對 μmax、λ 和h0影響的預(yù)測模型的建立，為其在食品中的安全控制提供理論依據(jù)。