呂小健，許引，董攀飛，徐蘭英，李士明，龍濤，*，王運利

（1.武漢紡織大學 化學與化工學院，湖北 武漢 430200；2.黃岡師范學院 化學化工學院 催化材料制備及應用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000）

陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium），為蕓香科柑桔屬植物橘（Citrus eticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，是一種傳統(tǒng)的藥食同源的材料[1]，具有燥濕化痰、理氣健脾等功效[2]。現(xiàn)代藥理作用研究表明，陳皮中多甲氧基黃酮類成分具有抗炎[3]、抗癌[4]、抗動脈粥樣硬化[5]、抗氧化[6]等生物活性。因此，陳皮近年來被廣泛開發(fā)為各種功能性保健食品、食用香料添加劑等[7]。

多甲氧基黃酮（polymethoxyflavones，PMFs）是柑橘種屬中所特有的黃酮類化合物[8]，在柑橘種屬果皮中含量尤為豐富，其分子空間構型呈平面型，極性較小，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等有機溶劑[9]。陳皮中多甲氧黃酮提取的傳統(tǒng)方法有索氏提取法[10]、有機溶劑提取法[11]、酶解提取法[12-13]、超聲輔助提取法[14]、微波輔助提取法等[15]，然而這些方法存在耗時長、操作過程繁瑣、收率較低、大量使用有機溶劑造成環(huán)境污染等缺點。本研究運用超臨界CO2流體萃取法，其原理是用高壓狀態(tài)下的液態(tài)CO2進行萃取，然后減壓使CO2氣化，釋放出萃取產物。該提取工藝不僅總黃酮得率高，而且具有后續(xù)產品分離工藝簡單、無溶劑污染等優(yōu)點。

川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮、橘皮素在陳皮中的含量較為豐富，是陳皮中3種主要多甲氧基黃酮，本文以這3種黃酮總量作為江西陳皮總多甲氧基黃酮含量指標，通過Box-Behnken組合試驗設計、響應面法探究超臨界CO2流體萃取陳皮多甲氧基黃酮最佳工藝，為陳皮的開發(fā)與綜合利用提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮：黃州匯康藥材批發(fā)市場，產地為江西。

無水乙醇、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：上海國藥集團化學試劑有限公司；液態(tài)CO2（純度99.5%）黃岡大江東有限公司；川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素標準品為催化材料制備及應用湖北省重點實驗室自制（已通過核磁和質譜鑒定結構，含量采用高效液相色譜峰面積歸一化法計算均不低于98%）。

1.2 儀器與設備

HA220-50-06 型超臨界流體萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；CCA-20 型低溫冷卻水循環(huán)泵、SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DS-5510DT 型超聲波清洗器：上海生析超聲儀器有限公司；BSA124S 分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；LC-20A 型高效液相色譜儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 陳皮預處理

陳皮于烘箱中60℃條件下干燥12 h，粉碎后過40 目篩，取粗顆粒進行萃取試驗。

1.3.2 工藝流程

陳皮→干燥→粉碎→過篩→稱重→超臨界萃取→總黃酮萃取液→旋蒸干得到稠膏→HPLC 分析檢測，計算川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的總得率。

1.3.3 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件

GL Sciences Intersil C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（梯度：0～15 min，40%～50 % 乙腈；15 min～20 min，50 %～70 % 乙腈；20 min～25 min，70%～85%乙腈；25 min～30 min，85%～40%乙腈）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：326 nm；進樣量：10 μL。

1.3.4 川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素標準溶液工作曲線的繪制及其得率的計算

精密稱取0.005 0 g 川陳皮素標準品，用色譜級甲醇超聲波輔助溶解于10 mL 的容量瓶中，定容，配制成0.5 mg/mL 的標準物質的儲備液。采用逐步稀釋法得到0.5、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5 mg/mL 等一系列不同質量濃度的標準工作溶液，過0.22 μm 濾膜后進樣，HPLC 檢測分析。根據(jù)濃度對峰面積繪制工作曲線，得到川陳皮素標準曲線方程為Y=31.719X+89.264（R2=0.999 9），按照以上方法得3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的標準曲線方程分別為Y=22.683X+140143（R2=0.9995）和Y=37.632X+10.145（R2=0.9999）。

將超臨界萃取液旋蒸得稠膏并稱重（m1），取適量稠膏（m2）超聲輔助溶解于色譜甲醇，并定容到一定體積（V），HPLC 檢測，將峰面積代入工作曲線方程，得川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的濃度，再按公式（1）計算總得率：

式中：X1、X2和X3分別為稠膏中川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素的濃度，μg/mL；ω 為總黃酮得率，mg/g；V 為稠膏定容后所得體積，mL；m0為陳皮原料質量，g；m1為稠膏質量，g；m2為取出稠膏的質量，mg。

1.3.5 超臨界CO2萃取的單因素試驗

在超臨界CO2流體萃取中，固定萃取分離罐Ⅰ、Ⅱ的溫度分別為45、50℃，壓力分別為6、8 MPa，在乙醇挾帶劑用量為300 mL 的條件下，以萃取得到的川陳皮素、3，5，6，7，8，3'，4'-七多甲氧基黃酮和橘皮素3種黃酮總量作為總多甲氧基黃酮得率，探索萃取時間分別為30、60、90、120、150 min，萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，萃取壓力分別為15、20、25、30、35 MPa時對陳皮中總多甲氧基黃酮得率的影響，初步確定各單因素的影響程度和最佳萃取條件。

1.3.6 總黃酮萃取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 方法，以萃取時間（A）、萃取溫度（B）和萃取壓力（C）3個因素為自變量，以總多甲氧基黃酮得率為響應值，進行響應面優(yōu)化見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 萃取時間對總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

在萃取釜溫度為50℃，壓力為20 MPa，乙醇挾帶劑用量為300 mL 的條件下，萃取時間分別為30 min、60、90、120、150 min 時，分別計算總多甲氧基黃酮萃取得率，結果如圖1所示。

圖1 時間對總黃酮得率影響曲線圖Fig.1 Effect of time on the yield of total PMFs

由圖1可見，萃取時間從30 min 到90 min，總多甲氧基黃酮得率持續(xù)上升，萃取時間為90 min 時總多甲氧基黃酮得率達到最大，90 min 之后隨著萃取時間延長，總多甲氧基黃酮得率不再繼續(xù)增加。這是因為萃取剛開始時，由于CO2流體與陳皮粉末顆粒未達到充分接觸，因而收率較低；后續(xù)隨著萃取時間延長，CO2流體與陳皮顆?；旌显絹碓匠浞郑瑐髻|速率提高，因而總多甲氧基黃酮得率快速增加；當總多甲氧基黃酮得率達到最大值后，由于陳皮粉末顆粒中的多甲氧基黃酮成分含量大大降低，隨萃取時間延長，總多甲氧基黃酮得率并無明顯增加。因此，確定最佳萃取時間為90 min。

2.2 萃取溫度對總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

在萃取釜壓力為20 MPa，萃取溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，乙醇挾帶劑用量300 mL 條件下萃取90 min，分別計算總多甲氧基黃酮萃取得率，結果如圖2所示。

圖2 溫度對總黃酮得率影響曲線圖Fig.2 Effect of temperature on the yield of total PMFs

由圖2可見，在溫度為35℃到55℃之間，隨溫度升高，總多甲氧基黃酮得率不斷增加，55℃時得率達到最大值，之后隨溫度上升，總多甲氧基黃酮得率反而呈現(xiàn)下降趨勢。溫度對超臨界流體溶解能力的影響較為復雜，在一定壓力條件下，溫度升高有利于溶質揮發(fā)和擴散，從而使萃取得率增大；另一方面，溫度過高時超臨界流體密度降低，多甲氧基黃酮在超臨界流體中的溶解度減小，不利于萃取。綜上可確定最佳萃取溫度為55℃。

2.3 萃取壓力對總多甲氧基黃酮萃取得率的影響

固定萃取釜溫度為55℃，壓力分別為10、15、20、25、30 MPa，乙醇挾帶劑用量300 mL 條件下，萃取90 min，分別計算總多甲氧基黃酮的萃取得率，結果如圖3所示。

圖3 壓力對總黃酮提取率影響曲線圖Fig.3 Effect of pressure on the yield of total PMFs

由此可見，壓力從10 MPa 升高到25 MPa 時，總多甲氧基黃酮得率從呈明顯上升趨勢，壓力為25 MPa 時多甲氧基黃酮得率最高，總當壓力超過25 MPa 時，總多甲氧基黃酮萃取得率基本保持不變。這是因為萃取溫度一定時，隨壓力增加，CO2流體密度增大，溶劑的溶解能力隨之增大，因而多甲氧基黃酮萃取得率增加。但當壓力達到一定值后，CO2流體液態(tài)性質明顯，繼續(xù)增加壓力，流體密度及溶解能力改變較小，因而多甲氧基黃酮萃取得率變化不大。且壓力增加，操作風險增大，因此固定萃取壓力為25 MPa。

2.4 響應面試驗優(yōu)化陳皮多甲氧基黃酮萃取工藝

以萃取時間（A）、萃取溫度（B）和萃取壓力（C）為考察因素，以總多甲氧基黃酮得率為響應值，進行響應面試驗設計，設計結果如表2所示，方差分析見表3。

表2 萃取工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results of optimal response Surface for extraction process

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Regression equation analysis of variance

將試驗數(shù)據(jù)利用Design Expert 軟件對各因素進行多元回歸擬合，得到以得率為響應值的二階線性回歸方程為：Y =1.69 +0.077A +0.16B +0.17C +0.040AB -0.037AC+0.11BC-0.21A2-0.070B2-0.23C2。

由表3可知，該回歸模型的P 值〈0.000 1，說明回歸模型的影響達到極顯著水平；模型的失擬項P〉0.05，表明失擬項不顯著。模型的總決定系數(shù)R2=0.975 3，表明該模型能解析97.53%的響應變化，說明該模型擬合良好。校正決定系數(shù)R2Adj=0.943 4，說明該模型響應值的變化有94.34%來源于所選變量。響應值Y 的變異系數(shù)CV=4.16%〈5%，說明試驗的重復性良好。萃取條件的3個因素對響應值的影響大小順序為A〈B〈C。一次項A、B、C，交互項BC，二次項A2，B2影響極顯著（P〈0.01），二次項C2項影響顯著（P〈0.05）；其他因素影響不顯著（P〉0.05）。通過Design-Expert 軟件繪制萃取時間和溫度、萃取時間和壓力、萃取溫度和壓力交互作用的響應面及等高線，結果見圖4。

圖4 各因素兩兩交互作用影響的響應面Fig.4 Response Surface of the interaction of various factors

由圖4b可知，總多甲氧基黃酮得率隨著萃取溫度和壓力的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，曲面較為陡峭，等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明萃取溫度和壓力的交互作用極顯著（P〈0.01）；由圖4a 和4c可知，曲面較平緩，等高線呈現(xiàn)圓形，說明萃取時間和壓力間、萃取時間和溫度間的交互作用不顯著（P〉0.01）。

2.5 響應面條件的確定

通過Design Expert 預測分析得到陳皮中總多甲氧基黃酮的最佳萃取工藝條件為萃取時間66.9 min，溫度55℃，壓力28 MPa，得率達到1.879 mg/g?？紤]到實際操作的可行性，萃取工藝參數(shù)調整為萃取時間67 min，溫度55℃，壓力28 MPa，在此條件下，做3 次平行試驗，總多甲氧基黃酮得率為1.89 mg/g，與預測值相對偏差為0.59%，表明響應面法優(yōu)化得到的陳皮中總多甲氧基黃酮的萃取工藝條件是可靠的。

3 結論

本研究運用超臨界CO2流體萃取技術，對陳皮中的多甲氧基黃酮進行萃取。試驗以總多甲氧基黃酮得率為指標，探討了時間、溫度、壓力3個條件對超臨界CO2流體對陳皮中多甲氧基黃酮萃取的影響，萃取條件對總多甲氧基黃酮得率影響大小依次為壓力、溫度和時間，根據(jù)單因素試驗確定最佳萃取條件為壓力25 MPa、溫度55℃、萃取時間為90 min。在此基礎上進行響應面法優(yōu)化并結合操作可行性，得到最佳萃取工藝條件為萃取時間67 min，溫度55℃，壓力28 MPa，總黃酮得率達到1.89 mg/g。