劉文英， 李 軍， 王 甜， 鄭雪婷， 郭 剛， 張文寶,3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室, 烏魯木齊 830054)

棘球蚴病(echinococcosis)俗稱包蟲病，由細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus, E.g)和多房棘球蚴(E.multilocularis, E.m)感染所致，分別稱為囊型包蟲病(Cystic echinococcosis, CE)和泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis, AE)分別占棘球蚴病所占病例的95%和5%[1]。棘球絳蟲完成生活史需要兩種宿主，即中間宿主和終末宿主。終末宿主主要是犬[2-3]。E.g在犬小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲，感染45 d后發(fā)育為帶有孕節(jié)的成蟲釋放蟲卵，蟲卵隨糞便排出體外，污染外環(huán)境[4]。通過模仿犬體內(nèi)腸道內(nèi)環(huán)境，體外培養(yǎng)原頭蚴向成蟲發(fā)育，是探索棘球絳蟲成蟲發(fā)育的基礎(chǔ)，可以為診斷試劑和疫苗的研發(fā)及抗蟲藥物的篩選提供支持條件[5-6]。原頭蚴具有雙向發(fā)育的特點，即在中間宿主體內(nèi)可以繼發(fā)性感染，原頭蚴發(fā)育為包囊；原頭蚴被犬吞食后，在犬的小腸內(nèi)發(fā)育為成蟲。雙向發(fā)育可以在體外培養(yǎng)獲得，在無膽汁的培養(yǎng)基中原頭蚴向成囊發(fā)育，反之則向成蟲發(fā)育。前期研究發(fā)現(xiàn)，原頭蚴的外翻和維持對于其向成蟲方向發(fā)育至關(guān)重要[7]。但獲得較為一致的外翻原頭蚴和體外獲取高比例的成蟲極為困難，其關(guān)鍵是對影響原頭蚴外翻和維持成蟲發(fā)育的因素不甚了解。本研究參考Smyth等[8-9]推薦的E.g體外培養(yǎng)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并在此基礎(chǔ)上，通過設(shè)立不同實驗分組，探討培養(yǎng)基添加膽汁，胰蛋白酶和提前純水刺激對原頭蚴體外培養(yǎng)成蟲發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器全培養(yǎng)基[RPMI-1640培養(yǎng)基含終濃度為25%的胎牛血清(Gibco)，0.4%酵母(美國Sigma公司)，0.4%葡萄糖(美國Sigma公司)及100 μg/mL雙抗(Hyclone公司)]用0.22 μm濾器過濾后備用,20%犬膽汁(新鮮采集于犬，用生理鹽水稀釋5倍后過濾備用),1%胃蛋白酶(美國Sigma公司，用Hanks液新鮮配置，Hanks液事先用濃HCl調(diào)pH值至2.0,10%胰蛋白酶(美國Sigma公司)。培養(yǎng)的設(shè)備包括CO2恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，成像系統(tǒng)，超凈工作臺，恒溫水浴鍋和pH計。

1.2 原頭蚴的收集和前處理在超凈工作臺內(nèi)無菌操作采集細粒棘球絳蟲原頭蚴，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3～5遍，沉淀的原頭蚴用胃蛋白酶消化，消化方法如下：在50 mL的離心管加入1份體積的沉淀原頭蚴和10倍原頭蚴沉淀體積的1%胃蛋白酶(pH2.0)，置37℃恒溫水浴鍋中消化約30 min，每隔5分鐘混搖1次。消化好的原頭蚴用PBS漂洗5遍后，用含1%雙抗的PBS懸浮備用。

1.3 膽鹽刺激原頭蚴外翻試驗經(jīng)胃蛋白酶消化后的原頭蚴用0.1%亞甲基藍染色，成活率>98%的原頭蚴加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入200 μL培養(yǎng)基含2 μL原頭蚴，分為7個組:A～G組分別含有0、0.005%、0.02%、0.25%、0.5%、1%、5%濃度的犬膽汁，每個實驗組設(shè)立1個復(fù)孔對照。原頭蚴的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)溫度為38.5℃，5% CO2和100%的濕度，培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h。用倒置顯微鏡觀察。

1.4 胰蛋白酶刺激試驗

1.4.1 胰蛋白酶刺激原頭蚴 消化后的原頭蚴分別加入含終濃度為0.02%犬膽汁和不同終濃度(0%、0.005%、0.01%、0.25%、0.5%、1%、5%)胰蛋白酶的全培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察48 h內(nèi)原頭蚴的外翻和死亡率變化。

1.4.2 胰蛋白酶對原頭蚴的作用 用含有不同濃度胰蛋白酶的全培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)原頭蚴21 d，每周換液2次，每次換液一半。分為7個組:(1)第1組為全培養(yǎng)基，其中添加終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%的犬膽汁，培養(yǎng)3 d后換液逐步去除胰蛋白酶，維持膽汁終濃度為0.02%；(2)第2～4組為全培養(yǎng)基，其中分別添加終濃度為0.01%、0.05%、0.25%的胰蛋白酶并含有0.02%的犬膽汁；(3)第5組為初次添加終濃度為0.25%的胰蛋白酶和0.02%的犬膽汁，培養(yǎng)3 d后換液逐步去除膽汁；(4)第6組為無胰酶含0.02%犬膽汁全培養(yǎng)基；(5)第7組為全培養(yǎng)基無犬膽汁和胰蛋白酶組。每個實驗組設(shè)立1個復(fù)孔對照，觀察方式同前。

1.5 純水刺激試驗把消化后的原頭蚴放入純水中，分別刺激0、0.5、3、5、10、15、30及60 min，加入生理鹽水終止，用0.1%亞甲基藍染色1 min，鏡下觀察低滲透壓對原頭蚴外翻和蟲體死亡的影響，然后根據(jù)對原頭蚴的不同處理方式，分為3個組：第8組為將消化后原頭蚴直接放入含0.25%犬膽汁全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第9組為用純水刺激30 s后，放入含0.25%犬膽汁全培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第10組為直接放入不含犬膽汁全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 膽鹽刺激對原頭蚴外翻的影響犬膽汁終濃度在0.02%時，48 h培養(yǎng)原頭蚴外翻率最高，可達62.7%。當犬膽汁終濃度超過0.25%時，原頭蚴外翻率反而出現(xiàn)降低，見圖1。

2.2 胰蛋白酶刺激

2.2.1 胰蛋白酶刺激對原頭蚴死亡率的影響 當固定全培養(yǎng)基犬膽汁終濃度為0.02%時，胰蛋白酶終濃度低于0.25%，原頭蚴培養(yǎng)48 h內(nèi)，死亡率為0。當胰蛋白酶終濃度為0.5%時，48 h死亡率為13.7%，原頭蚴開始出現(xiàn)死亡；胰蛋白酶終濃度為1%時，原頭蚴培養(yǎng)48 h后，死亡率為89.5%，對原頭蚴殺傷作用明顯；胰蛋白酶終濃度為5%時，原頭蚴培養(yǎng)12 h后可出現(xiàn)全部死亡。故選取終濃度為0.25%的胰蛋白酶開展后續(xù)實驗，見圖2。

2.2.2 胰蛋白酶對原頭蚴體外培養(yǎng)生長發(fā)育的影響 在培養(yǎng)第21天，原頭蚴外翻率在不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=312.17，P<0.05)，見表1。其中第1組、第2組及第5組原頭蚴外翻率最高，可達60%以上。3組間頭節(jié)外翻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但加胰酶組蟲體形態(tài)變得細長見圖3a，圖4。第4組原頭蚴外翻率在培養(yǎng)第21天均明顯出現(xiàn)下降。第6組在原頭蚴培養(yǎng)第21天，絕大部分(>95%)向成囊方向發(fā)育，第7組原頭蚴培養(yǎng)21 d則幾乎都向成囊發(fā)育，見圖3b，圖5。

表1 改變胰蛋白酶濃度對原頭蚴后續(xù)培養(yǎng)頭節(jié)外翻的影響

注：體外培養(yǎng)第21天， 與第1組相比，*P<0.05; 與第2組相比，▲P<0.05; 與第3組相比，▼P<0.05; 與第4組相比，●P<0.05; 與第5組相比，★P<0.05。

圖3 培養(yǎng)21 d原頭蚴的形態(tài)變化(×40)

注：箭頭所示圖a(第1組：成蟲性狀發(fā)育體型細長)，圖b(第7組：微囊)

2.3 純水刺激試驗

2.3.1 純水刺激時間對原頭蚴外翻和蟲體死亡的影響 低滲水刺激原頭蚴3 min后，鏡檢蟲體開始出現(xiàn)腫脹、死亡，且隨著時間的延長死亡率逐漸上升，60 min后基本上無存活原頭蚴。第1次用低滲水刺激30 s后，原頭蚴外翻率達40%以上，與未用水刺激前相比頭節(jié)外翻率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.34，P=0.013)原頭蚴經(jīng)2次在室溫下30 s的刺激，原頭蚴外翻率達到100%。因此選擇30 s低滲水刺激原頭蚴開展后續(xù)實驗,見圖6。

a: Eg(0 d) b: Eg(1 d) c: Eg(7 d) d: Eg(21 d)

圖4 第1組不同時間段原頭蚴的形態(tài)變化(×40)

a: Eg(0 d) b: Eg(1 d) c: Eg(7 d) d: Eg(21 d)

圖5 全培養(yǎng)基中原頭蚴不同時間段的形態(tài)變化(×40)

2.3.2 純水刺激對原頭蚴后續(xù)培養(yǎng)頭節(jié)外翻的影響 在培養(yǎng)開始前5 d，低滲水刺激原頭蚴30 s再培養(yǎng)(第8組)頭節(jié)外翻率高于直接培養(yǎng)組，頭節(jié)外翻率明顯升高，但培養(yǎng)24 h后，外翻原頭蚴復(fù)原，成蟲發(fā)育第20天與對照(第9組)無差別(t=0.27，P=0.79)，之后直接培養(yǎng)組原頭蚴外翻率迅速上升，培養(yǎng)第30天觀察直接培養(yǎng)組頭節(jié)外翻率已達80%，明顯高于低滲水刺激再培養(yǎng)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.50，P<0.01)。在無犬膽汁無水刺激培養(yǎng)基組(第10組)，則在第20天已無頭節(jié)外翻原頭蚴，見表2。

表2 純水刺激原頭蚴30 s后再培養(yǎng)頭節(jié)外翻變化

3 討論

E. g生活史經(jīng)歷蟲卵-六鉤蚴-原頭蚴-成蟲等多個階段，原頭蚴發(fā)育階段是該絳蟲生活史的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。原頭蚴體外培養(yǎng)受溫濕度、培養(yǎng)基成份等多種因素影響。在不含犬膽汁單相培養(yǎng)體系中，含胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基更適合原頭蚴成囊生長，原頭蚴在第10天開始向囊發(fā)育，在第35～40天可出現(xiàn)肉眼可見的微囊[10]。Zhang等[11]將體外培養(yǎng)發(fā)育的微囊繼發(fā)感染小鼠34周后進行解剖，發(fā)現(xiàn)所有小鼠均被成功感染，成囊率可達75%。然而有研究報道在含犬膽汁的雙相培養(yǎng)體系中，原頭蚴體外培養(yǎng)則會向成蟲方向發(fā)育，在第17～23天會出現(xiàn)一個節(jié)片，25～30 d出現(xiàn)2個節(jié)片，37～40 d出現(xiàn)3個節(jié)片，50～55 d出現(xiàn)4個節(jié)片[12]。本實驗原頭蚴體外成蟲培養(yǎng)21 d出現(xiàn)第1個節(jié)片，所得結(jié)果與之相同。

原頭蚴在終末宿主腸道內(nèi)向成蟲發(fā)育受到諸多因素限制，包括胃蛋白酶消化、膽鹽、胰蛋白酶以及純水刺激等。有研究顯示，細粒棘球絳蟲發(fā)育在終末宿主腸道內(nèi)原頭蚴的外翻，成蟲的生長，中間宿主腸道內(nèi)蟲卵的孵化和六鉤蚴的激活都需要有膽酸鹽的參與[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，犬膽汁終濃度為0.02%較適宜原頭蚴的外翻，培養(yǎng)20 d以后原頭蚴的外翻仍然維持較好的水平，外翻率可達67%。而無膽汁培養(yǎng)基90%以上的原頭蚴發(fā)育為包囊。即便前期添加犬膽汁，如果在培養(yǎng)期間去除，原頭蚴依然會向成囊方向發(fā)育。因此培養(yǎng)過程中維持適量犬膽汁濃度對原頭蚴的成蟲發(fā)育必不可少。

有研究發(fā)現(xiàn)，用0.25%胰蛋白酶對原頭蚴蟲體會產(chǎn)生消化作用，原頭蚴對胰蛋白酶終濃度>0.5%的培養(yǎng)基耐受性較差[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，胰酶并不能提高原頭蚴的外翻，但是低濃度的胰酶濃度有利于原頭蚴的成蟲性狀發(fā)育。有關(guān)胰酶與原頭蚴發(fā)育關(guān)系的研究較少，這是今后需要繼續(xù)關(guān)注的一個方面。

本研究發(fā)現(xiàn)，純水刺激原頭蚴30 s會明顯提高其頭節(jié)外翻率且不會發(fā)生死亡，這可能與原頭蚴對低滲透壓環(huán)境較為敏感，大量原頭蚴受到刺激后短時間內(nèi)發(fā)生頭節(jié)外翻有關(guān)。但隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)前30 s的純水刺激不能促進原頭蚴的頭節(jié)外翻。甚至培養(yǎng)到第30天左右反而出現(xiàn)無純水刺激的原頭蚴外翻率維持水平更高的現(xiàn)象，當然這還需要做重復(fù)實驗進一步加以確認。

本研究觀察到的膽鹽，胰蛋白酶和純水對E. g原頭蚴生長發(fā)育產(chǎn)生的作用，其機制還有待于進一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等研究手段來加以闡明。