王 晨

（上海東郁園林科技有限公司，上海浦東 200135）

剪股穎粒線蟲（Anguina agrostis）是牧草和草坪上重要的有害生物，被我國(guó)列入檢疫性有害生物名錄[1]。1997年～2003年，我國(guó)口岸曾數(shù)次在進(jìn)口草籽中截獲該線蟲，但此后10余年來我國(guó)未見有記錄截獲該線蟲[2-4]。2017～2018年，上海口岸先后2次分別在進(jìn)境草籽中截獲該線蟲，現(xiàn)將檢疫過程中的體會(huì)整理如下，以期為口岸檢疫部門提供技術(shù)參考。

1 截獲

2018年3月，上海進(jìn)口一批美國(guó)俄勒岡州細(xì)弱剪股穎（Agrostis tenuis）草種，總重11.34t。3月28日在外高橋港口采集樣品并送到實(shí)驗(yàn)室。鑒于美國(guó)是剪股穎粒線蟲的分布區(qū)，且剪股穎植物是該線蟲的典型寄主，故對(duì)送檢的樣品進(jìn)行仔細(xì)檢查。經(jīng)前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用直接挑取蟲癭法分離獲得的粒線蟲數(shù)量較多，故采用直接挑取蟲癭法檢驗(yàn)該批樣品。獲取蟲癭后，用挑針刺破蟲癭，有大量線蟲逸出。將獲得的線蟲采用形態(tài)學(xué)及分子相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，經(jīng)確認(rèn)該線蟲是剪股穎粒線蟲。

2 檢測(cè)過程中的體會(huì)

2.1 加大對(duì)重點(diǎn)樣品的檢測(cè)力度

近年來，我國(guó)草籽進(jìn)口量越來越大，其中禾本科草籽占多數(shù)。剪股穎粒線蟲的寄主較廣泛，可為害禾本科植物10多個(gè)屬，其中黑麥草屬（Lolium sp.）、早熟禾屬（Poa spp.）、羊茅屬（Festuca spp.）等草籽都是我國(guó)進(jìn)口量較大的草籽[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)、加拿大、丹麥、新西蘭、荷蘭等國(guó)是我國(guó)草種進(jìn)口的主要國(guó)家，上述國(guó)家均有剪股穎粒線蟲分布，應(yīng)引起檢疫部門高度重視[1,5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)口岸曾在彎葉畫眉草、剪股穎、匍匐莖剪股穎（Agrostis stolonifera）、細(xì)弱剪股穎（Agrostis tenuis）中截獲剪股穎粒線蟲，口岸若發(fā)現(xiàn)這類樣品應(yīng)重點(diǎn)查驗(yàn)[2-4]。

2.2 線蟲的分離方法

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)剪股穎草籽、匍匐莖剪股穎、細(xì)弱剪股穎等剪股穎屬（Agrostis）草籽類樣品，采用直接挑取蟲癭法分離粒線蟲具有分離數(shù)量大、耗時(shí)少的優(yōu)點(diǎn)，故對(duì)該類樣品采用直接挑取蟲癭法進(jìn)行分離。挑取時(shí)要注意每次選取的樣品盡量少，以使樣品盡量散開平鋪，互相不重疊。當(dāng)發(fā)現(xiàn)顏色較深（黑色或棕色）的雜質(zhì)時(shí)（見圖1），盡量都挑取出來。進(jìn)一步置于解剖鏡下觀察。

圖1 正常植物種子與蟲癭比較（箭頭部位為蟲癭）

圖2 解剖鏡下正常植物種子與蟲癭比較（上方2粒種子為正常植物種子；下方2粒種子為蟲癭）

經(jīng)觀察，典型的剪股穎粒線蟲草籽，頭尾略尖，中間較寬，呈紡錘形；比正常的植物種子大一些（圖2）。對(duì)疑似蟲癭的雜質(zhì)，滴入數(shù)滴清水，稍加濕潤(rùn)后，采用解剖針挑破、刺破，進(jìn)一步觀察是否有線蟲逸出。

2.3 線蟲的鑒定

采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。可采用28S和ITS區(qū)通用引物擴(kuò)增線蟲核糖體DNA，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析；也可參照國(guó)標(biāo)中的特異引物對(duì)線蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察是否產(chǎn)生特異性條帶[6]。

3 總結(jié)

近年來，我國(guó)牧草及草坪草種子進(jìn)口量較大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011～2014年，上?？诎哆M(jìn)境種子數(shù)量達(dá)5.373萬t，其中禾本科種子占絕大多數(shù)，占總量的92.87%。剪股穎粒線蟲是禾本科植物非常重要的病原線蟲，口岸應(yīng)加大檢疫力度，以防該線蟲傳入我國(guó)。