薛亞飛，宮艷杉，祁晶晶，卜慧敏，楊永勝，陳妍，高萌萌，胡青海

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）主要侵害鴨，也可感染鵝、火雞等禽類，有研究報(bào)道從呈滲出性肺炎的病豬肺臟中也分離到RA[1]。RA引起的鴨傳染性漿膜炎，是一種高致病性、接觸性的傳染病，感染鴨呈急性或慢性敗血癥，特征性的病理變化有纖維素性肝周炎、氣囊炎、心包炎、腦膜炎等。RA感染發(fā)病率可達(dá)10%～60%，死亡率為30%～90%，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病之一[2]。

目前對RA哪些蛋白參與其對宿主細(xì)胞的粘附和入侵等致病機(jī)制還知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室前期以細(xì)菌感染Vero細(xì)胞作為感染模型來分析RA對宿主細(xì)胞的粘附和入侵能力[3]，但Vero細(xì)胞不是RA感染的自然宿主細(xì)胞，用其分析RA的粘附和入侵能力可能與細(xì)菌感染自然宿主的細(xì)胞有所差異。因此，本研究制備了RA感染鴨的靶器官細(xì)胞-肝細(xì)胞（鴨胚肝原代細(xì)胞），比較了RA野生株Th4株與ompA基因缺失株和回復(fù)株對鴨胚肝細(xì)胞和Vero細(xì)胞的粘附和入侵能力。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒RATh4株由本實(shí)驗(yàn)分離、鑒定并保存；RAompA基因缺失株Th4ΔompA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[3]；E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pRES1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 缺失株Th4ΔompA回復(fù)株的構(gòu)建 以提取的RATh4株基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增Th4株ompA基因的ORF（compA-F：GCTAGACTCGAG ATGAAAAATCTAAAATTAGGAATTTCAGCA；compA-R: GCTAGGCATGCAGGACGCTTTTCTA TTTAAGATTA），PCR產(chǎn)物連入pGEM-T easy載體后測序，得到T-ompA。用XhoI和SphI雙酶切T-ompA，回收目的片段，再與經(jīng)同樣雙酶切的穿梭表達(dá)載體pRES1連接，構(gòu)建得到互補(bǔ)質(zhì)粒pRES1-ompA。以大腸桿菌S17-1（pRES1-ompA）為供體菌，RA基因缺失株Th4ΔompA為受體菌，采用雙親本接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將回復(fù)質(zhì)粒導(dǎo)入缺失株中，用含卡那霉素50 μg/mL、紅霉素2 μg/mL的TSA平板進(jìn)行篩選。用PCR分別擴(kuò)增ermF基因、RA的16S rRNA基因和ompA基因，利用Western blot檢測OmpA的表達(dá)進(jìn)行鑒定?；蛐蜑?6S rRNA＋ermF＋ompA＋的接合子克隆為ompA基因缺失株的回復(fù)株，命名為cTh4ΔompA。

1.3 鴨胚肝原代細(xì)胞的制備 取15～18日齡鴨胚，無菌取出肝臟組織于培養(yǎng)皿中，PBS清洗3次后剪至糜狀，然后用膠原酶IV置于37℃消化10 min，1000×g離心，棄上清，沉淀用DMEM重懸，重復(fù)3次，最后1次離心完畢以后，用William’s培養(yǎng)基重懸沉淀，用Cell Strainer過濾以后平鋪于24孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 鴨疫里默氏桿菌Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對鴨胚肝細(xì)胞的粘附與入侵

1.4.1 細(xì)菌粘附能力測定 待細(xì)胞在孔內(nèi)長至90%單層，用DMEM培養(yǎng)基洗3次；每孔加200 μL新鮮菌液（2×107CFU/mL），200×g離心5 min，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h；用DMEM培養(yǎng)基洗3次，每孔加200 μL 0.25%胰蛋白酶，37℃消化10 min，再加入800 μL DMEM培養(yǎng)基，用移液器反復(fù)吹至鴨肝細(xì)胞懸浮，10倍系列稀釋后，每個(gè)稀釋度各取100 μL涂布TSA 瓊脂平板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.2 細(xì)菌入侵能力測定 24 孔板中每孔加入200 μL 細(xì)菌孵育1.5 h，洗滌后再加入含有慶大霉素（100 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基1 mL，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。用DMEM培養(yǎng)基洗3次，同上加胰酶消化，稀釋后涂TSA瓊脂平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。粘附和入侵試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 鴨疫里默氏桿菌Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對Vero細(xì)胞的粘附與入侵 待24孔板中新鮮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞長至90%單層時(shí)，用DMEM培養(yǎng)基洗3次，每孔加200 μL稀釋好的新鮮菌液（1×107CFU/孔），200×g離心5 min，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，用DMEM培養(yǎng)基洗3次。細(xì)菌的粘附與入侵試驗(yàn)同上述1.4步驟，同樣也各重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 缺失株Th4ΔompA回復(fù)株的構(gòu)建及鑒定 采用PCR從鴨疫里默氏桿菌Th4野生株中擴(kuò)增ompAORF，克隆至T載體并測序，再連入大腸桿菌-鴨疫里默氏桿菌穿梭表達(dá)載體pRES1，構(gòu)建得到互補(bǔ)質(zhì)粒pRES1-ompA。然后用接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將質(zhì)粒pRES1-ompA轉(zhuǎn)入缺失株Th4ΔompA中，得到缺失株的互補(bǔ)菌株cTh4ΔompA。ermF和ompA基因擴(kuò)增結(jié)果為陽性，說明互補(bǔ)質(zhì)粒pRES1-ompA已成功導(dǎo)入Th4ΔompA缺失株內(nèi)，16s rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果為陽性說明該菌株為RA，互補(bǔ)株cTh4ΔompA已構(gòu)建成功（圖1和圖2）。

圖1 缺失株Th4ΔompA的互補(bǔ)菌株cTh4ΔompA的PCR鑒定Fig. 1 Identifi cation of the complemented strain cTh4ΔompA by PCR

2.2 鴨疫里默氏桿菌Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對鴨胚肝細(xì)胞的粘附與入侵能力 比較鴨疫里默氏桿菌Th4株、基因缺失株Th4ΔompA以及互補(bǔ)株cTh4ΔompA在接菌比為100∶1的情況下對鴨肝細(xì)胞的粘附入侵能力。應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析，P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，與野生株Th4株相比，缺失株Th4ΔompA對鴨胚肝細(xì)胞的粘附和入侵能力分別降低了3.32倍和2.25倍，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；互補(bǔ)株cTh4ΔompA相對于Th4ΔompA粘附和入侵能力均明顯回復(fù)（圖3A和3B）。

圖2 互補(bǔ)株cTh4ΔompA中OmpA蛋白的表達(dá)Western blot檢測Fig. 2 Detection of the expression of OmpA in the complemented strain cTh4ΔompA by Western blot

2.3 鴨疫里默氏桿菌Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對Vero細(xì)胞的粘附與入侵能力 比較鴨疫里默氏桿菌Th4株、基因缺失株Th4ΔompA以及互補(bǔ)株cTh4ΔompA在接菌比為100:1的情況下對Vero細(xì)胞的粘附入侵能力，應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析，P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義確立的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，與野生株Th4株相比，Th4ΔompA對Vero細(xì)胞的粘附和入侵能力都顯著下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；回復(fù)株cTh4ΔompA相對于Th4ΔompA粘附和入侵能力均顯著地回復(fù)（圖4A和4B）。另外，從圖3和圖4可看出，在相同的接種量和感染比時(shí)，野生株Th4、缺失株Th4ΔompA和互補(bǔ)株cTh4ΔompA對鴨胚肝細(xì)胞的粘附和入侵能力（細(xì)胞數(shù)）均高于Vero細(xì)胞。

3 討論

粘附是病原微生物感染宿主細(xì)胞的第一步。病原微生物首先粘附到宿主細(xì)胞，隨后定植，從而發(fā)揮一系列的致病作用。對于病原微生物感染早期，粘附更是非常關(guān)鍵的一步。粘附的過程一般可以分為兩步[4-6]，第一步是非特異性的，病原微生物借趨化作用接近宿主細(xì)胞表面，然后兩者借助靜電荷及疏水力結(jié)合；第二步是特異性的，病原微生物表面粘附素進(jìn)一步與相應(yīng)特異性受體結(jié)合。細(xì)菌的粘附作用被認(rèn)為是通過粘附素來實(shí)現(xiàn)的[7]。細(xì)菌粘附宿主細(xì)胞的過程比較復(fù)雜，并不只是一種粘附素或少數(shù)幾個(gè)分子發(fā)揮作用，常常是不同的粘附素與不同的宿主細(xì)胞表面受體相結(jié)合，所以一種細(xì)菌通常具有多種粘附素。Hu 等[3]通過同源重組的方法構(gòu)建得到了RA血清2型Th4株的ompA基因缺失株Th4ΔompA，并且通過研究發(fā)現(xiàn)Th4ΔompA對Vero細(xì)胞的粘附入侵能力較親本株顯著下降，推測得出OmpA是RA的一種粘附因子。本研究中RA對鴨胚肝細(xì)胞和Vero細(xì)胞的粘附入侵試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步佐證了這一推測。

圖3 Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對鴨胚肝細(xì)胞的粘附（A）和入侵（B）能力比較Fig.3 The adherence and invasion capacity of R. anatipestifer strains Th4, Th4ΔompA and cTh4ΔompA to duck embryo liver cells

圖4 Th4、Th4ΔompA、cTh4ΔompA對Vero細(xì)胞的粘附（A）和入侵（B）能力比較Fig.4 The adherence and invasion capacity of R. anatipestifer strains Th4, Th4ΔompA and cTh4ΔompA to vero cells

與Vero細(xì)胞相比，RA對鴨胚肝細(xì)胞粘附入侵的數(shù)量都有所增加，這可能是由于鴨是RA的自然感染宿主，且肝臟是其感染的靶器官之一。這也是本研究選取鴨肝細(xì)胞作為細(xì)胞模型來研究RA粘附入侵宿主的主要原因。以往的研究多選用重復(fù)性好，易培養(yǎng)的傳代細(xì)胞系（如Vero細(xì)胞和Hela細(xì)胞等）作為細(xì)菌體外模擬粘附入侵的細(xì)胞模型，這些細(xì)胞系多為來自腫瘤細(xì)胞的無限繁殖細(xì)胞系。近年來，各實(shí)驗(yàn)室也在不斷探索使用靶細(xì)胞作為粘附入侵的感染模型。王棟等[8]應(yīng)用雞胚成纖維細(xì)胞作為禽致病性大腸桿菌的細(xì)胞感染模型，通過構(gòu)建evfC的基因缺失株和互補(bǔ)株，證明VI型分泌系統(tǒng)2的核心組分evfC基因?qū)η葜虏⌒源竽c桿菌的粘附和侵襲沒有影響。李玲[9]以鴨胚成纖維細(xì)胞作為細(xì)胞模型，證明RA能夠粘附入侵鴨胚成纖維細(xì)胞（duck embryo fibroblast，DEF），并且誘導(dǎo)DEF細(xì)胞死亡。用細(xì)胞松弛素B、秋水仙素處理細(xì)胞后，可顯著抑制RA對DEF細(xì)胞的侵襲，證明RA對DEF的侵襲過程有賴于細(xì)胞骨架的重排。采用不同濃度蛋白酶K對細(xì)菌進(jìn)行處理，可顯著抑制RA的黏附力，表明RA的黏附需要細(xì)菌蛋白的參與。由于RA主要感染肝臟組織，因此本研究用鴨胚肝原代細(xì)胞取代Vero細(xì)胞來分析RA對宿主細(xì)胞的粘附和入侵能力，結(jié)果表明與鴨成纖維細(xì)胞相比，采用靶器官肝臟細(xì)胞能更好地模擬RA感染鴨體內(nèi)（肝臟）的情況，為進(jìn)一步研究RA的致病機(jī)制提供了一種有效的手段。