尹皓嬋 李莉莉 宋宛霖等

摘要 茶樹原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，是一種喜溫畏寒的植物，北方冬季寒冷干燥，會造成茶樹的凍害。因此，茶樹抗寒機(jī)理的研究對北方茶樹的規(guī)模種植和增產(chǎn)具有重要意義?；诘蜏孛{迫下茶樹的主要生理變化，從糖代謝途徑、Ca2+信號途徑，ABA、CBF /DREB誘導(dǎo)抗寒基因的表達(dá)幾個方面綜述了茶樹的抗寒機(jī)理研究進(jìn)展，并介紹了抗寒機(jī)理在茶樹育種、栽培中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 低溫脅迫;抗寒機(jī)理;茶樹

中圖分類號 S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）04-0022-04

Abstract Camellia sinensis was originated in the tropical and subtropical regions， which was suitable in warm rather than cold area. When planted in Northern China， tea plants were often usually destroyed by frozen damage in cold and dry winter. Therefore， researching the mechanism of cold resistance of Camellia sinensis was of great significance for the largescale planting and yield increase of northern tea plant. In this research， we reviewed the main physiological changes and resistance mechanism of tea plant in low temperature with the aspects of carbohydrate metabolism pathway， Ca2+ signaling pathway， ABA and CBF/DREB gene expression. In addition， application of the mechanism of cold resistance in tea plant breeding and cultivation was also introduced.

Key words Cold stress;Cold resistance mechanism;Camellia sinensis

低溫脅迫（cold stress，CS）作為植物生長的非生物脅迫之一，會表現(xiàn)在植物反應(yīng)的不同方面，限制植物種植、生長和地理分布。這些反應(yīng)是通過CS影響光合作用、能量代謝、活性氧（ROS）穩(wěn)定、膜流動性和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生的。CS可能通過一系列破壞過程引起植物損傷，包括微細(xì)胞器破壞、細(xì)胞和組織脫水、細(xì)胞膜脂質(zhì)相變、ROS產(chǎn)生及其伴隨的氧化活力等。由于細(xì)胞受到損傷，一系列針對CS的細(xì)胞反應(yīng)可歸類為防御機(jī)制，即調(diào)節(jié)植物代謝途徑，提高對低溫的抵抗能力的過程，稱為冷馴化（cold acclimation，CA）。CA是一個復(fù)雜的過程，通過包括特定冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞滲透穩(wěn)定化、改變脂質(zhì)和脂肪酸膜成分、增加抗氧化活性、能量代謝等途徑提高抗寒性[1-2]。

茶樹（Camellia sinensis）是一種多年生常綠木本植物，主要生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)，最適生長溫度為20～25 ℃，在我國主要分布于西南、華南、江南地區(qū)。20世紀(jì)五六十年代，經(jīng)過一系列的試驗實現(xiàn)了“南茶北引”，在山東實現(xiàn)了茶樹的規(guī)模種植，但是北方的茶樹在冬季和春季仍受到顯著的低溫脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，山東茶樹中維生素、氨基酸、兒茶素和礦物質(zhì)等成分的含量顯著高于南方茶樹，保健效果也更顯著[3]。自引種以來，北方各茶樹基地在茶樹越冬防護(hù)技術(shù)方面取得一系列進(jìn)展，例如設(shè)置防護(hù)屏障、行間鋪草蓋草、改良土壤、合理灌溉修剪、適量施肥等[4-5]。由于從冷馴化過程中獲得的耐寒能力增強(qiáng)，茶樹進(jìn)入冬眠休眠階段，以保障茶樹越冬。然而，茶樹幼苗的萌芽期在春末易受霜凍影響，在短期內(nèi)遭受嚴(yán)重負(fù)面影響，主要包括組織損傷和發(fā)育遲緩。因此解決凍害問題是提高北方茶樹產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵。

關(guān)于茶樹抗寒性，前期研究主要集中在生物膜保護(hù)系統(tǒng)的組分含量和活性與抗寒性的關(guān)系，如茶樹冷馴化前后蛋白含量、糖含量的變化，從而在揭示抗寒性與膜保護(hù)系統(tǒng)、冷誘導(dǎo)特異蛋白的變化關(guān)系方面取得一定進(jìn)展[6-10]。此外，Wang等[11]利用RNA測序（RNA-Seq）和數(shù)字基因表達(dá)（DGE）技術(shù)初步闡明了自然冷馴化期間成熟茶葉抗寒性的機(jī)制，鑒定的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄物表明“糖類代謝途徑”和“Ca2+途徑”可能在茶樹對低溫脅迫的反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。2018年高立志界上分布最廣的中國種茶樹全基因組被破解，為抗寒性在基因?qū)用娴难芯縿?chuàng)造了有利條件。筆者基于低溫脅迫下茶樹的主要生理變化，從糖代謝途徑、Ca2+信號途徑，ABA、CBF/DREB誘導(dǎo)抗寒基因的表達(dá)幾個方面對茶樹的抗寒機(jī)理研究進(jìn)行介紹。此外，對抗寒機(jī)理在茶樹育種、栽培中的應(yīng)用也進(jìn)行了介紹[12-13]。

1 低溫脅迫下茶樹的生理變化

當(dāng)茶樹受到低溫脅迫時，一些生理指標(biāo)可以反應(yīng)茶樹受到凍害的程度，包括細(xì)胞膜的損傷，可溶性蛋白、可溶性糖、束縛水、自由水含量的變化及酶活性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。原生質(zhì)膜透性會發(fā)生不同程度的增大，導(dǎo)致原生質(zhì)不同程度的外滲，從而介質(zhì)電導(dǎo)率會有不同程度的加大，電導(dǎo)率越大表明受凍害愈嚴(yán)重[14]。茶樹葉片的含水量也會發(fā)生變化，隨著溫度下降，束縛水含量上升，自由水含量下降[15]。李葉云等[16]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片中的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量均隨低溫脅迫的加劇呈先升后降的變化趨勢?？梢酝ㄟ^糖的積累降低冰點，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力;通過糖的代謝，產(chǎn)生其他保護(hù)性物質(zhì)及能源[17]。受低溫脅迫的直接或間接影響茶樹體內(nèi)的多種酶發(fā)生活性變化。黃華濤等[18]的研究結(jié)果表明，受冬季低溫影響，茶樹葉片中過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POX）活性提高，且POX同工酶譜帶同時增加。黃建安[19]對越冬期間成熟葉片進(jìn)行低溫（0～15 ℃）處理，結(jié)果表明各品系中過氧化物歧化酶（SOD）和CAT 活性隨溫度的降低和處理時間的延長呈不同程度的降低，SOD 同工酶總活性及酶帶數(shù)在不同的處理溫度和處理時間也不同程度的降低或減少。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)短期低溫脅迫后，與成熟葉片相比，茶樹幼葉表現(xiàn)出褐變，電解質(zhì)滲漏顯著增加，并且葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/ Fm）的最大光化學(xué)效率顯著降低。

2 糖類相關(guān)基因與抗寒性的關(guān)系

越冬期間，茶樹糖類相關(guān)基因的差異表達(dá)以及總糖和幾種特定糖（包括蔗糖，葡萄糖和果糖）含量的變化說明了冷馴化過程中糖類代謝的重要作用，但CA和糖類之間在茶樹中的相互作用仍然不清楚[21-22]。Yue等[23]調(diào)查了整個冬季茶葉中糖含量的變化和大量糖相關(guān)基因的表達(dá)。在CA期，糖類代謝相關(guān)基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，其中β-淀粉酶基因（CsBAM），轉(zhuǎn)化酶基因（CsINV5）和棉子糖合成酶基因（CsRS2）參與淀粉、蔗糖和蔗糖棉子糖代謝而且分別穩(wěn)定上調(diào);除了CsSWEET2，3，16，CsERD6.7和CsINT2下調(diào)外，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)普遍受到刺激;糖信號相關(guān)的CsHXK3和CsHXK2在CA早期具有相反的表達(dá)模式。這些提供了CA對碳水化合物影響的相關(guān)信息，表明糖積累有助于茶樹在冬季的耐寒性，并提出了一種簡單的糖調(diào)節(jié)模型來響應(yīng)低溫脅迫。當(dāng)植物感受到低溫脅迫時，CBF轉(zhuǎn)錄因子刺激了大量與冷相關(guān)的基因。糖類代謝基因，決定冷應(yīng)激反應(yīng)的糖含量變化。糖類可作為主要的滲透保護(hù)劑，糖類的積累可作為能量、基質(zhì)等方面的資源儲備，因此糖含量積累的越多，茶樹的耐寒性越高。糖類通過其調(diào)節(jié)劑激發(fā)一系列轉(zhuǎn)錄程序的信號，例如SnRK1，HXK和TOR以調(diào)節(jié)與低溫相關(guān)的基因表達(dá)，并可以介導(dǎo)ABA或乙烯合成以提高對低溫的應(yīng)力（圖1）。

3 Ca2+和ABA對茶樹抗寒基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用

3.1 Ca2+

植物遭受低溫脅迫時主要調(diào)節(jié)途徑之一是Ca2+ 信號通路[24]，CaM是細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號的一種重要受體蛋白，是鈣離子信號通路傳遞的第一關(guān)，CaM參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)控、光合作用、花粉萌發(fā)和激素反應(yīng)、抵御逆境脅迫等各種生命活動過程[25-27]。黃玉婷等[28]以獲得的茶樹冷馴化轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，低溫脅迫下CsCaM含量逐漸增加，推測CaM蛋白能夠通過鈣信號通道發(fā)揮作用，進(jìn)而與茶樹的抗寒性有關(guān)。通過分析CsCaMs 在低溫條件下施用外源鈣調(diào)素拮抗劑W7、鈣離子通道抑制劑LaCl3以及外源CaCl2處理下的表達(dá)情況可知，抑制劑導(dǎo)致鈣離子信號通道受阻。

3.2 ABA

早在20世紀(jì)八十年代，就有研究證明植物的抗寒性與ABA有關(guān)。外源ABA能誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而提高植物的抗寒性。植物激素在低溫脅迫反應(yīng)中也是重要的信號調(diào)節(jié)劑，特別是調(diào)節(jié)多種信號，如低溫、光照、生長和代謝，根據(jù)基因表達(dá)對ABA的依賴與否，可將低溫下信號傳導(dǎo)ABA誘導(dǎo)的基因分為3類：①基因表達(dá)依賴ABA的傳導(dǎo)，如種子貯藏蛋白基因和逆境誘導(dǎo)基因;②冷誘導(dǎo)基因表達(dá)不依賴ABA的傳導(dǎo)途徑;③ABA與低溫共同作用控制基因的表達(dá)[29]。Xu等[30]研究顯示，低溫脅迫誘導(dǎo)ABA的合成，且外源ABA能夠提高植株的抗寒性，說明ABA在植物適應(yīng)低溫環(huán)境中具有重要作用。Yue等[31]鑒定了參與編碼GA和ABA代謝和信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵酶的30個基因，評估的基因在不同的茶植物器官中表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式，多樣性與茶樹的幼芽活性—休眠周期有關(guān)。這些結(jié)果均表明，參與GA和ABA代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因?qū)φ{(diào)節(jié)茶樹幼芽的活性—休眠轉(zhuǎn)換至關(guān)重要。

4 CBF /DREB調(diào)控茶樹抗寒基因表達(dá)

一些冷誘導(dǎo)基因已經(jīng)從茶樹中分離出來，如恢復(fù)/脫水反應(yīng)元件結(jié)合因子基因CsCBF1和CsCBF3[21，32-33]，水通道蛋白基因CsTIP1;1和CsTIP1;3，堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子基因CsbZIP15[34]，和己糖激酶基因CsHXK3和CsHXK4[35]。

CBF/DREBs的刺激可誘導(dǎo)大量冷應(yīng)答基因（CORs）的表達(dá)，可調(diào)控多個低溫基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)鑒定了DREB1A的100多個下游靶基因[36-40]。這些基因在植物中的許多產(chǎn)物，包括晚期胚胎含有豐富的蛋白質(zhì)、滲透保護(hù)劑生物合成的酶、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶已被證明在獲得脅迫耐受性和進(jìn)一步調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)中起作用。誘導(dǎo)DREB1基因觸發(fā)冷應(yīng)激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應(yīng)，然后誘導(dǎo)許多冷應(yīng)激反應(yīng)和耐寒性中起作用的基因。Kidokoro等[41]研究顯示，CaM結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子3（CAMTA3）和CaM結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子5（CAMTA5）參與了快速低溫，但不是逐漸降低溫度的冷應(yīng)答信號傳導(dǎo)途徑。Yin等[21]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除茶葉中的低溫脅迫，脫落酸和干旱處理誘導(dǎo)了CsCBF3外，還觀察到CsCBF3基因調(diào)節(jié)冷應(yīng)答途徑的下游基因如AtCOR15a和AtCOR78的表達(dá)。這些結(jié)果均表明，CsCBF3在響應(yīng)冷脅迫中起重要作用，并為提高茶樹耐冷性的分子育種研究提供了方向。此外，Zhu等[42]研究結(jié)果表明CsSPMS基因能夠快速誘導(dǎo)冷脅迫。Wu等[43]研究結(jié)果表明，AP2/ERF TFs可能在茶樹異常溫度脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

5 提高茶樹抗寒性的方法

5.1 施用外源物質(zhì)

研究發(fā)現(xiàn)，對茶樹施用外源物質(zhì)可提高其抗寒性，主要表現(xiàn)為提高其可溶性糖、可溶性蛋白、酶活性、氨基酸含量等。褪黑素涉及植物發(fā)育和非生物脅迫反應(yīng)，Li等[44]研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，在4 ℃低溫處理的茶樹中觀察到葉片中葉綠素含量降低和丙二醛水平升高。與低溫處理相比，褪黑素處理后茶葉葉綠素含量顯著增加，丙二醛水平顯著降低。此外，外源褪黑素通過增加保護(hù)性酶的活性來增強(qiáng)抗氧化能力。黃玉婷等[45]施用鈣離子信號抑制劑W-7、LaCl3處理均能提高與抗寒性相關(guān)的茶樹葉片生理指標(biāo)，鈣離子信號系統(tǒng)在茶樹抗寒過程中發(fā)揮了重要作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，在越冬期施用含有褐藻寡糖的海藻發(fā)酵液在提高茶樹抗寒性時效果最優(yōu)，表現(xiàn)為提高茶樹的保護(hù)酶活性、可溶性糖、可溶性蛋白含量，降低茶樹葉片的相對電導(dǎo)率，促進(jìn)植物根系生長。褐藻寡糖與茶樹抗寒性之間的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

5.2 冷馴化

研究結(jié)果表明，在一定時間和程度的低溫脅迫下，茶樹發(fā)生適應(yīng)性變化，能夠在一定程度上提高抗寒性，這個過程稱為冷化[46]。楊亞軍等[47]將茶樹在15 ℃平衡生長15 d，將所處環(huán)境降低4～5 ℃馴化21 d后脫馴化7 d，發(fā)現(xiàn)馴化后相比未經(jīng)馴化的茶樹抗寒能力有所提升，表明茶樹抗寒力獲得需要經(jīng)過一定的馴化才能表現(xiàn)出來。

5.3 培育優(yōu)良品種

近年來我國也相繼培育出一些抗寒性強(qiáng)的優(yōu)良茶樹品種，如安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系選育出特早生特抗寒茶樹新品種“農(nóng)抗早”和早生抗寒優(yōu)質(zhì)茶樹新品系“茶農(nóng)1號”;浙江大學(xué)茶葉研究所選育出早生優(yōu)質(zhì)抗寒茶樹新品種“浙農(nóng)117”;泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院選育出“羅漢1號”[6]，主要表現(xiàn)為發(fā)芽早，倒春寒對其傷害小。傳統(tǒng)的茶葉繁殖過程（由于其木質(zhì)、多年生和自交不親和等特性而更復(fù)雜。因此，將標(biāo)記輔助選擇（MAS）、基因組選擇（GS）與傳統(tǒng)應(yīng)用方法適當(dāng)結(jié)合對于茶樹育種技術(shù)改進(jìn)十分必要。目前，茶樹種群的遺傳多樣性評估已用不同的標(biāo)記進(jìn)行[48]。研究發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記在種質(zhì)多樣性評估和茶樹育種中很受歡迎[49]。茶樹育種的成功在很大程度上取決于對遺傳背景、多樣性、關(guān)系和評估的正確認(rèn)識。利用高通量分子標(biāo)記可以確定具有可遺傳或可重現(xiàn)特征的個體選擇[50]。

6 展望

自20世紀(jì)五六十年代開始，引種茶樹于北方在農(nóng)藝方面取得了許多進(jìn)展，目前山東已建立了茶樹種植基地，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)北方茶樹具有氨基酸含量高、礦物質(zhì)豐富、對人體保健功能尤為顯著等特點。由于北方的氣候原因，每年茶樹都會受到不同程度的凍害，因此解決北方茶樹的凍害問題是提高茶樹產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑。目前在茶樹的抗寒機(jī)制研究方面取得了很多進(jìn)展，包括調(diào)控茶樹抗寒基因表達(dá)的研究、調(diào)控茶樹抗寒的信號通路研究、茶樹的抗性育種研究以及施加外源物質(zhì)提高茶樹抗寒性的研究。但在茶樹抗寒機(jī)理和育種方面尚有難點值得深入研究，需要通過遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、植物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等學(xué)科研究人員共同努力，從而在提高茶樹抗寒性及抗寒育種方面取得進(jìn)展。

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