孟云 陶曼芝 吳席 曹樹(shù)青 樊婷婷

摘要[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表達(dá)模式及其對(duì)重金屬鎘脅迫的響應(yīng)機(jī)制，以野生型擬南芥為材料構(gòu)建CTSP3-GUS重組質(zhì)粒及GUS轉(zhuǎn)基因植株。[方法]通過(guò)提取野生型擬南芥的DNA，克隆其啟動(dòng)區(qū)基因片段，將基因片段和pART27-GUS質(zhì)粒雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR和測(cè)序獲得陽(yáng)性單克隆。然后將CTSP3-GUS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，獲得陽(yáng)性單菌落。接著采用浸花法侵染野生型擬南芥，最后通過(guò)抗性篩選和PCR鑒定獲取CTSP3-GUS轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)果]成功克隆CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段，構(gòu)建出重組質(zhì)粒，獲得了CTSP3-GUS轉(zhuǎn)基因植株。 [結(jié)論]獲得CTSP3-GUS轉(zhuǎn)基因植株，為接下來(lái)進(jìn)一步研究該基因在植物響應(yīng)鎘脅迫機(jī)制中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞擬南芥;CTSP3;載體;轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號(hào)Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）03-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.027

重金屬污染已經(jīng)成為世界性重大環(huán)境問(wèn)題之一，其中重金屬鎘污染尤為嚴(yán)重。過(guò)多的鎘會(huì)對(duì)動(dòng)植物細(xì)胞組織造成不可逆的損傷[1-3]。在重金屬鎘逆境中，植物通過(guò)控制金屬流入、促進(jìn)金屬泵出、重金屬螯合等途徑來(lái)應(yīng)激[4]。運(yùn)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)植物品種進(jìn)行優(yōu)化改良是解決重金屬污染的最佳方式[5]。研究發(fā)現(xiàn)CTSP3功能缺失突變體對(duì)重金屬鎘脅迫表現(xiàn)出耐受的表型，所以筆者擬通過(guò)克隆CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因，獲得CTSP3-GUS植株，以進(jìn)一步研究植物基因CTSP3的基因表達(dá)模式及其對(duì)重金屬鎘脅迫的響應(yīng)機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料。植物材料是哥倫比亞（Columbia， col）遺傳背景的擬南芥（Arabidopsis thaliana），從美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心獲得，由合肥工業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室繁殖所得。載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pART27-GUS，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101。

1.1.2主要試劑及酶類。

Plasmid? miniprep Kit （TIANGEN），T4-DNA Ligase（NEB），PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa），限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ（NEB），Hind Ⅲ（NEB），Easy Taq DNA Polymerase（TransGen），Agar， DNA loading buffer，異丙醇，氯仿，無(wú)水乙醇等。

1.2方法

1.2.1擬南芥無(wú)菌苗培養(yǎng)。

配制1/2MS固體培養(yǎng)基，取出存儲(chǔ)于4 ℃冰箱的1/2MS培養(yǎng)基，按比例稱取蔗糖瓊脂和1/2MS，溶解調(diào)pH至5.8，封膜后高壓蒸汽滅菌，滅菌結(jié)束后倒培養(yǎng)基至玻璃培養(yǎng)皿中。用0.1%氯化汞對(duì)種子殺菌消毒后，將種子均勻點(diǎn)在已凝固的培養(yǎng)基中。4 ℃冰箱中春化2 d，在恒溫（22 ℃左右）培養(yǎng)室中光照豎直培養(yǎng)14 d，定期觀察擬南芥生長(zhǎng)情況。

1.2.2擬南芥DNA的提取。將培養(yǎng)皿中的擬南芥取出，放入研缽中，加650 μL已預(yù)熱的CTAB，研磨至溶液狀裝入管中。65 ℃水浴45?? min拿出靜置到室溫，加入650 μL酚氯彷劇烈混勻，離心吸取上清液，加900 μL無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，-20 ℃沉淀2 h。離心，棄上清后加75%乙醇，離心，棄上清，倒置使殘留乙醇完全揮發(fā)。加入40 μL無(wú)菌水溶解DNA，獲得DNA溶液。

1.2.3CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段的克隆。

利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)以下引物進(jìn)行CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段的克隆。上游引物為FP：5′-CGGGGTACCTCTTCAGTAGTAACGTTGCG-3′，下游引物為RP：5′-CCCAAGCTTTTCCTCTCTACCTTCTT-3′，以DNA為模板進(jìn)行基因克隆。

1.2.4大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。

取出-80 ℃冰箱中存儲(chǔ)的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。解凍后，吸取10 μL質(zhì)粒或連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴35? min，42 ℃水浴60 s，再冰上靜置2 min。加600 μL無(wú)菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，放在37 ℃搖床中低速振蕩培養(yǎng)1～2 h。待菌液渾濁后，涂布于LB+壯觀霉素的平板上。平板倒置放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

過(guò)夜培養(yǎng)后挑取培養(yǎng)皿單菌落，接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，渾濁后PCR鑒定和測(cè)序。

1.2.5農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。

取出存儲(chǔ)于冰箱中的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，解凍。取2 μL質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，吸取至已預(yù)冷的0.1 cm電擊杯中，電擊后迅速加入600 μL無(wú)菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)1～2 h至渾濁，涂布于LB+壯觀霉素的平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)皿上挑取單菌落接種于LB+壯觀霉素的液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)渾濁，PCR鑒定。

1.2.6花序侵染法獲取轉(zhuǎn)基因擬南芥。

將陽(yáng)性農(nóng)桿菌接種于含壯觀霉素的LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD600=1.2～1.4，離心去上清，用侵染緩沖液重懸至溶液OD600=0.8～1.2，最后加入一定量的SilwettL-77混勻，侵染花序，黑暗處理12 h。隔8 d，再次侵染。

1.2.7轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株鑒定。

將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性篩選，培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，將具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗移栽至土質(zhì)培養(yǎng)基中，提取DNA，經(jīng)PCR鑒定正確后，即獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

2結(jié)果與分析

2.1擬南芥CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段的克隆

為了驗(yàn)證CTSP3基因在擬南芥鎘耐受機(jī)理中的作用，構(gòu)建CTSP3-GUS載體。以野生型擬南芥DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，所選取啟動(dòng)區(qū)長(zhǎng)度1 928 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.2目的片段和質(zhì)粒雙酶切

基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)時(shí)，在上下游引物分別添加了限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基，使用限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ對(duì)基因克隆獲得CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段和pART27-GUS質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切。酶切以后，電泳檢測(cè)，酶切后的基因片段和載體質(zhì)粒條帶清晰，大小正確（圖2）。

2.3連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性克隆鑒定

T4連接酶將酶切后的基因片段與質(zhì)粒片段連接，連接產(chǎn)物采取熱擊法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆菌落于加有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁。

對(duì)上一步所得單克隆菌液PCR鑒定，所用引物為CTSP3啟動(dòng)區(qū)片段擴(kuò)增引物，結(jié)果如圖3所示。除了2號(hào)與5號(hào)菌落，其他菌落PCR條帶與CTSP3啟動(dòng)區(qū)基因片段大小一致，說(shuō)明其為陽(yáng)性克隆。選取1號(hào)菌液進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與CTSP3啟動(dòng)區(qū)序列完全吻合，說(shuō)明成功構(gòu)建CTSP3-GUS載體。

2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及花序浸染

將測(cè)序正確的CTSP3 -GUS重組質(zhì)粒通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101，培養(yǎng)在慶大霉素和壯觀霉素抗生素培養(yǎng)基，挑取單菌落PCR驗(yàn)證。電泳結(jié)果如圖4所示，所選單克隆菌株均為陽(yáng)性單菌落。

2.5CTSP3 -GUS轉(zhuǎn)基因植株的抗性篩選

獲取侵染后的擬南芥種子，37 ℃干燥，4 ℃春化后撒在含有卡那霉素抗性的MS平板上。恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，長(zhǎng)出來(lái)的小苗（具有長(zhǎng)根，子葉顏色嫩綠）可能為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，如圖5所示。

2.6CTSP3 -GUS轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定

將篩選出陽(yáng)性植株移載至土壤中，置于專用培養(yǎng)室中恒溫光照培養(yǎng)，20 d后提取轉(zhuǎn)基因植株DNA，進(jìn)行鑒定。PCR鑒定結(jié)果如圖6所示，篩選所得植株均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，即CTSP3-GUS轉(zhuǎn)基因植株。

3討論

土壤重金屬污染是世界性的重大問(wèn)題，鎘作為基本礦物質(zhì)元素[6]，通過(guò)礦物吸收機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。土壤鎘污染直接危害植物生長(zhǎng)、動(dòng)物和人類的健康[7]。目前，植物修復(fù)法是治理鎘污染最有效的方法。

該試驗(yàn)自擬南芥種子資源中心獲得CTSP3基因功能缺失型突變體[8-10]，前期研究結(jié)果顯示CTSP3基因參與了植物對(duì)

鎘脅迫的響應(yīng)，因此通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建CTSP3-GUS重組載體[11-12]，將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。這為研究CTSP3基因在植物中的表達(dá)模式和鎘耐受調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用提供了依據(jù)，是一個(gè)非常關(guān)鍵的課題。

參考文獻(xiàn)

[1] SHIM D， HWANG J U， LEE J，et al.Orthologs of the class A4 heat shock transcription factor HsfA4a confercadmium tolerance in wheat and rice[J].Plant cell，2009，21：4031-4043.

[2] TAMS L，MISTRK I，ALEMAYEHU I A.Low Cd concentrationactivated morphogenic defence responses are inhibited by high Cd concentration-induced toxic superoxide generation in barley root tip[J].Planta，2014，239（5）：1003-1013.

[3] CHEN F，WANG F，WU F B，et al.Modulationof exogenous glutathione in antioxidant defense system against Cd stress in the two barley genotypes differing in Cd tolerance[J].Plant Physiol Biochem，2014，48（8）：663-672.

[4] STRAIF K， BENBRAHIMTALLAA? L， BAAN? R，et al.A? review of human carcinogensPart C：Metal， arsenic， dusts， and fibres[J].Lancet? Oncol，2009，10（5）：453-454.

[5] KHNLENZ T，SCHMIDT H，URAGUCHI S，et al.Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase 2 is constitutively active in vivo and can rescue the growth defect of the PCS1deficient cad13 mutant on Cdcontaminated soil[J].J Exp Bot，2014，65（15）：4241-4253.

[6] HALL J L.Cellular mechanisms for heavy metal detoxificationandtolerance[J].J Exp Bot，2002，53：1-11.

[7] CLEMENS S.Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis[J].Planta，2001，212（4）：475-486.

[8] BELHAJ K， CHAPARROGARCIA A， KAMOUN S， et al.Plant genome editing made easy：Targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system [J].Plant methods， 2013， 9（1）：1-10.

[9] SIEMIANOWSKI O，BARABASZ A，KENDZIOREK M，et al.HMA4 expression in tobacco reduces Cd accumulation due to the induction of the apoplastic barrier[J].J Exp Bot，2014，65（4）：1125-1139.

[10] YAO J，KONG Q N，ZHU H Y，et al.Content and fractionation of Cu， Zn and Cd in size fractionated municipal solid waste incineration bottom ash[J]. Ecotox Environ Safe，2013，94：131-137.

[11] ZIENTARA? K，? WAWRZYN'SKA? A，UKOMSKA? J，et al.Activity of the AtMRP3 promoter in transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum plants is increased by cadmium， nickel， arsenic， cobalt and lead but not by zinc and iron[J].J Biotechnol，2009，139（3）：258-263.

[12] ZHAI Z Y， GAYOMBA S R， JUNG H I，et? al.OPT3 is a phloemspecific? iron transporter that is essential for systemic iron signaling and redistribution of iron and cadmium in Arabidopsis[J].Plant cell，2014，26：2249-2264.