田小海 王莘

摘要 [目的]研究并優(yōu)化啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取工藝。[方法]生長(zhǎng)曲線(xiàn)法確定其培養(yǎng)時(shí)間，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，應(yīng)用低溫和葡聚糖凝膠（SephadexG-75）對(duì)凝血質(zhì)進(jìn)行純化。[結(jié)果]啤酒活性干酵母最佳培養(yǎng)時(shí)間為9 d，凝血質(zhì)提取優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇濃度85%、提取溫度35? ℃、第1次丙酮體積（丙酮∶粗提液）為0.7、恒溫磁力攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)為600 r/min，凝血質(zhì)提取量可以達(dá)到1 000 mL活化液0.660 g，純化率為13%。[結(jié)論]從啤酒活性干酵母可提取凝血質(zhì)，方法簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，降低凝血質(zhì)動(dòng)物來(lái)源的生成成本，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞啤酒活性干酵母;凝血質(zhì);提取;純化

中圖分類(lèi)號(hào)TS262.5+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）03-0147-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.047

凝血系統(tǒng)是人體發(fā)揮內(nèi)源性或外源性凝血途徑的物質(zhì)基礎(chǔ)，凝血物質(zhì)一般可分為經(jīng)典凝血和激肽2個(gè)系統(tǒng)[1]。凝血質(zhì)屬于經(jīng)典凝血系統(tǒng)中的凝血因子Ⅲ，當(dāng)凝血因子Ⅲ與其受體Ⅶa結(jié)合后，可通過(guò)啟動(dòng)外源性凝血途徑而發(fā)揮凝血作用[2]。

凝血質(zhì)來(lái)源較為廣泛，主要有中藥、動(dòng)物和微生物等。前人的研究主要集中在2種來(lái)源的凝血質(zhì)的提取，一種是從中藥中進(jìn)行凝血質(zhì)分離和提取，另一種是從試驗(yàn)動(dòng)物的血液中進(jìn)行提取和純化。中藥來(lái)源的凝血質(zhì)分離提取過(guò)程復(fù)雜、純化困難，獲取量少限制了其應(yīng)用;動(dòng)物源性的凝血質(zhì)為優(yōu)質(zhì)凝血質(zhì)，但難于從動(dòng)物體內(nèi)大量獲得，試驗(yàn)動(dòng)物獲取凝血質(zhì)生產(chǎn)成本較高，也限制了其應(yīng)用;微生物來(lái)源的凝血質(zhì)主要存在于半知菌綱的真菌中，啤酒活性干酵母中凝血質(zhì)含量豐富，容易擴(kuò)大培養(yǎng)，分離提取及純化工藝相對(duì)容易，是獲得凝血質(zhì)的理想來(lái)源，但微生物來(lái)源的凝血質(zhì)的提取研究較少。筆者主要通過(guò)對(duì)啤酒活性干酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定確定凝血質(zhì)提取的時(shí)間，通過(guò)醇浸提，脫水后乙醚提取，再通過(guò)丙酮沉淀的方法進(jìn)行研究，達(dá)到優(yōu)化提取方案的目的。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。湖北安琪酵母公司提供安琪啤酒活性干酵母。

1.1.2試劑。葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、鐵粉、瓊脂、蒸餾水、不同濃度的乙醇、無(wú)水硫酸鈉、乙醚、丙酮、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、二巰基乙醇、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、鹽酸、甘氨酸、磷酸鹽緩沖溶液等。

1.1.3儀器。高壓蒸汽滅菌箱、光照培養(yǎng)箱、無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫水浴箱、多循環(huán)水式真空泵、恒溫磁力攪拌器、搖床、離心機(jī)、分析天平、搖床、pH計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)、分光光度計(jì)（可見(jiàn)光和紫外光）、冰箱、超聲波振蕩器、電泳儀、Sephadex G-75。

1.1.4培養(yǎng)基。

活化培養(yǎng)基[3]：葡萄糖2.5 g、蒸餾水100 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖40 g、蛋白胨和瓊脂各10 g、酵母膏5 g，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[4-5]：葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2 g、微量Fe粉，加水至500 mL，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1啤酒活性干酵母活化和擴(kuò)大培養(yǎng)[4-6]。

1.2.1.1菌種活化。2.5 g葡萄糖置于250 mL三角瓶中，加水100 mL，溶解后于電爐加熱煮沸，冷卻至35 ℃，即得活化液，121.3 ℃，103.4 kPa，滅菌20 min。啤酒活性干酵母0.2 g，35 ℃條件下加入活化液中，自然冷卻至30 ℃后，置于30 ℃水浴中活化2 h。

1.2.1.2斜面保存。取活化后菌種，在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行斜面接種，培養(yǎng)7 d，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3擴(kuò)大培養(yǎng)。取適量冷凍保存的菌種，接入40 mL（250 mL三角燒瓶）液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30 ℃搖床振蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 h，可用于凝血質(zhì)的提取分離。

1.2.2啤酒活性干酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定[7]。

250 mL活化液分別對(duì)生長(zhǎng)1～12 d的啤酒活性干酵母進(jìn)行測(cè)定，從培養(yǎng)24 h后開(kāi)始，每間隔24 h收集一次菌體，由于離心效果差，采用靜置沉降的方法收集菌體[8]，測(cè)定前采用200目篩網(wǎng)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，50 ℃以下對(duì)過(guò)濾得到的菌體進(jìn)行烘干處理后進(jìn)行稱(chēng)重，根據(jù)稱(chēng)重結(jié)果以發(fā)酵天數(shù)為橫坐標(biāo)、干菌體量為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)，即為生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.3啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取方法[9]。

啤酒活性干酵母干菌體在一定溫度下，通過(guò)一定濃度的乙醇浸提，獲得提取液;提取液在一定溫度下經(jīng)過(guò)濃縮，獲得膏狀物;膏狀物經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水后，再經(jīng)過(guò)乙醚提取，獲得乙醚提取液;乙醚提取液進(jìn)行濃縮，獲得濃縮物;濃縮物經(jīng)丙酮沉淀后，獲得凝血質(zhì)粗品。250 mL活化液對(duì)乙醇濃度、提取溫度、轉(zhuǎn)速、丙酮濃度影響因素采用正交試驗(yàn)L9（34） 確立最佳提取條件。

1.2.4啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的純化方法[10]。

除去脂類(lèi)物質(zhì)，如麥角固醇、卵磷脂等可以采用乙醚揮發(fā)和低溫沉淀除去。

準(zhǔn)確稱(chēng)取SephadexG-75 2.0 g置于燒杯中，加入250 mL雙蒸水溶脹48 h;取直徑為2 cm、高60 cm層析柱，關(guān)閉出口后加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液，緩慢加入溶脹好的凝膠顆粒，同時(shí)打開(kāi)出口使其緩慢沉積。緩慢注入磷酸鹽緩沖溶液，達(dá)到柱平衡后將溶解在磷酸鹽中的凝血質(zhì)粗品溶液緩慢加入凝膠柱，不斷用磷酸鹽緩沖溶液洗脫，同時(shí)收集洗脫液進(jìn)行干燥處理，即可得到純化的凝血質(zhì)。

2結(jié)果與分析

2.1啤酒活性干酵母活化及擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果

啤酒活性干酵母經(jīng)活化后保存的菌種接種于活化液12～16 h即可獲得較多菌體，為了便于試驗(yàn)過(guò)程的進(jìn)行，一般培養(yǎng)24 h后開(kāi)始使用菌體。

2.2啤酒活性干酵母的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

對(duì)培養(yǎng)1～12 d的啤酒活性干酵母設(shè)定3個(gè)重復(fù)，分別烘干菌體后取平均值，根據(jù)具體的干菌體量制作其生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

凝血質(zhì)是啤酒活性干酵母生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中的初級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，隨著菌體生成量的增多，凝血質(zhì)的產(chǎn)量也隨之增加，其凝血質(zhì)提取的最佳時(shí)期為8～10 d[11]，試驗(yàn)中確定第9天啤酒活性干酵母菌量最多，250 mL活化液最多可獲得1.27 g干菌量。

2.3啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的提取

通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）分析，各項(xiàng)影響因素的最佳水平組合為A2B2C2D1，即乙醇濃度為85%、提取溫度35 ℃、攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)600 r/min、丙酮濃度為70%。4種影響因素的重要性排序?yàn)锳>B>D>C，即乙醇濃度最重要，其次為提取溫度，再次為丙酮濃度，最后為攪拌器轉(zhuǎn)數(shù)。

優(yōu)化工藝后采用85%乙醇、35 ℃、600 r/min、丙酮濃度為70%的條件下再次提取粗品凝血質(zhì)的量為0.165 g。1 000 mL活化液提取凝血質(zhì)粗品量達(dá)0.660 g。

2.4啤酒活性干酵母凝血質(zhì)的純化

2.4.1啤酒活性干酵母凝血質(zhì)除脂類(lèi)物質(zhì)。

將凝血質(zhì)粗品置于-14 ℃冰箱中過(guò)夜，即可除去凝血質(zhì)粗品中含有的少量麥角固醇和卵磷脂，使用冷凍干燥機(jī)可迅速干燥。

2.4.2啤酒活性干酵母凝血質(zhì)經(jīng)葡聚糖凝膠純化。

將0.660 g粗品凝血質(zhì)經(jīng)SephadexG-75可純化為凝血質(zhì)成品，可獲得純化的凝血質(zhì)0.085 8 g，使得啤酒活性干酵母純凝血質(zhì)的純化率達(dá)13%。

3討論與結(jié)論

3.1啤酒活性干酵母的培養(yǎng)

對(duì)啤酒活性干酵母的培養(yǎng)也嘗試?yán)镁圃阒械某煞忠约疤菑S(chǎng)的廢糖蜜等作為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)正交試驗(yàn)確定蛋白飼料水、DDGS水、廢糖及酵母泥的最佳配比[12]，在培養(yǎng)原料上節(jié)省資源，便于擴(kuò)大培養(yǎng)和投入實(shí)際生產(chǎn)。但由于培養(yǎng)的效果沒(méi)有達(dá)到預(yù)期，因此，該試驗(yàn)中仍然采用了經(jīng)典的酵母菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，酵母菌對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分要求不高，僅在大量培養(yǎng)時(shí)消耗大量的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等成分。

3.2啤酒活性干酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

由于凝血質(zhì)為啤酒活性干酵母生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的初級(jí)代謝產(chǎn)物，因此，菌體的量越多，所含有的凝血質(zhì)越多，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)非常必要。對(duì)啤酒活性干酵母生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定可以采用干法或濕法2種測(cè)定方法。由于濕法測(cè)定中對(duì)于發(fā)酵液過(guò)濾的效果不能完全一致，因而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。但采用干法測(cè)定時(shí)，一定保證在烘干處理過(guò)程中溫度不能太高，否則會(huì)破壞蛋白質(zhì)的生物活性，導(dǎo)致其出現(xiàn)熱變性，因此溫度要嚴(yán)格控制在50 ℃以下。

3.3凝血質(zhì)提取過(guò)程中各種試驗(yàn)因素的影響

培養(yǎng)后獲得的啤酒活性干酵母細(xì)胞壁的破壞可以采用多種方法處理，可以采用破壁效果較好的破壁機(jī)處理，效果較好;采用超聲波破碎會(huì)使得細(xì)胞壁破壞不均勻，嚴(yán)重的會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白成分，輕微的又不能起到破壁作用，效果不好;研缽研磨僅適合實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)模試驗(yàn)，不適合擴(kuò)大生產(chǎn)。因此，該試驗(yàn)采用破壁機(jī)處理。

乙醇濃度過(guò)低（75%）浸提效果不好，濃度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生大量的難于與蛋白質(zhì)分離的物質(zhì)，且會(huì)造成乙醇的浪費(fèi)。提取的溫度過(guò)低，不利于凝血質(zhì)的釋放，溫度過(guò)高，容易造成凝血質(zhì)的部分活性的破壞或喪失。一次丙酮濃度過(guò)高會(huì)造成浪費(fèi)，但如果濃度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致其中殘留的乙醚無(wú)法徹底除去。磁力攪拌器轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)數(shù)高低的影響較小，但如果轉(zhuǎn)數(shù)過(guò)高容易造成溫度升高，要采用恒溫磁力攪拌器處理。因此，凝血質(zhì)提取過(guò)程中各種試驗(yàn)影響因素的具體參數(shù)為：乙醇濃度85%;提取溫度35 ℃;一次丙酮濃度70%;轉(zhuǎn)數(shù)為600 r/min。

3.4凝血質(zhì)提取及純化比較

啤酒活性干酵母發(fā)酵9 d干菌體量達(dá)1.270 g/250 mL活化液，凝血質(zhì)的提取量為0.165 g/250 mL活化液，提取率達(dá)12.992%，與文獻(xiàn)[13]中的提取率提高5百分點(diǎn);純化后凝血質(zhì)量為0.215 g/250 mL，純化率達(dá)13%，與文獻(xiàn)[13]中的純化率提高4百分點(diǎn)。因此，試驗(yàn)達(dá)到了提取優(yōu)化和純化改進(jìn)的效果。

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