張霞 康鑫 何先元

摘要[目的]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取黃荊葉總黃酮的工藝條件及月周期規(guī)律研究，為其開發(fā)利用提供技術(shù)參考。[方法]以9月份的黃荊葉粗粉為原料進(jìn)行優(yōu)化提取工藝研究，乙醇為提取溶劑，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以黃荊葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面法考察提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度和超聲功率對黃荊葉總黃酮提取率的影響，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗，建立回歸模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析，并根據(jù)最優(yōu)提取工藝提取4—11月黃荊葉的總黃酮，確定總黃酮含量的變化規(guī)律。[結(jié)果]9月份黃荊葉總黃酮超聲提取最佳工藝條件為：提取次數(shù)為3次，料液比為1.00∶50.25，乙醇濃度為50.59%，超聲功率比為41.94%，總黃酮提取得率可達(dá)10.48%;4—11月份中8月份的黃荊葉總黃酮含量最高，可達(dá)11.22%。[結(jié)論]響應(yīng)面法優(yōu)化黃荊葉總黃酮的提取條件切實可行，得到的回歸方程與試驗結(jié)果擬合性好，方法穩(wěn)定可靠，可為工業(yè)大生產(chǎn)提取黃荊葉總黃酮提供一定的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞黃荊葉;總黃酮;響應(yīng)面法;超聲提取;月周期規(guī)律

中圖分類號R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）03-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.03.050

黃荊（Vitex negundo L.），又名蚊子柴、五指柑、五指風(fēng)、布荊、荊條，為馬鞭草科植物的全株，主要分布于廣西各地，長江流域及南部其他省各有分布[1]。味苦、微辛，平;疏風(fēng)清熱，止咳化痰，截瘧[2];用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、水腫、流感、慢性支氣管炎、胃潰瘍、慢性胃炎、急性腸炎、頭風(fēng)痛、毒蛇咬傷[3]、腳癬[4]。黃荊葉含紫花牡丹素、黃酮、木犀草素-7-葡萄糖苷、四羥基-甲氧基黃酮-α-D-葡萄糖苷、揮發(fā)油、杜荊定堿及維生素C等[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃荊葉提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[6]，在體外抑菌作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、青霉和酵母有一定的抗菌作用[7-8]。黃酮作為黃荊葉中重要的生物活性成分之一，具有抑菌、抗氧化[9-10]、抗腫瘤[11]等藥理作用。筆者在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法[12-15]優(yōu)化超聲提取黃荊葉總黃酮工藝條件，在4—11月中確定總黃酮含量最高的月份，以期獲得適合工業(yè)大生產(chǎn)黃荊葉的總黃酮的提取方法和提取月份，并為該成分藥理活性的深入研究和黃荊葉資源的有效利用提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。

黃荊葉采自重慶醫(yī)科大學(xué)藥植園，4—11月每月15日中午采集黃荊葉，去除雜質(zhì)，陰干，粉碎封裝于塑料袋備用。

1.1.2試劑。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥92.5%，ID：RKP7-7SN4，中國食品藥品檢定研究院）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和無水乙醇均為分析純。

1.1.3儀器。

UV-1200型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;KQ5200DA超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1黃荊葉總黃酮提取工藝。

1.2.1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精確稱取干燥至恒重的蘆丁對照品5.000 mg，用60%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL在450～600 nm處測定吸收度，在510 nm處有最大吸收，故選510 nm為測定波長。分別移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于6個25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至10 mL，加入0.6 mL 5%NaNO2溶液搖勻，放置6 min;然后加入0.6 mL 10%Al（NO3）3搖勻，放置6 min;然后加入6 mL濃度為1.0 mo1/L的NaOH溶液，用60%乙醇定容，混合后搖勻，放置15 min。以試劑空白為參比，在510 nm處測吸光度。以蘆丁濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=12.730 8C+0.034 1（R2=0.999 9），表明在0.005～0.045 mg/mL吸光度與濃度的線性關(guān)系良好。

1.2.1.2黃荊葉總黃酮的提取。

將總黃酮陰干，粉碎后過40目篩，準(zhǔn)確稱取0.5 g置于50 mL燒杯中，按照一定的料液比、乙醇濃度、提取次數(shù)和超聲功率進(jìn)行超聲提取。提取完成后，過濾，合并濾液，濃縮，用50%乙醇定容至100 mL容量瓶中，即為樣品溶液，備用。

1.2.1.3總黃酮的含量測定。

取“1.2.1.2”項下定容后的樣品溶液0.5 mL于10 mL試管中，按照“1.2.1.1”項下的方法顯色后加60%乙醇溶液至10 mL刻度，在510 nm處測量吸光度，計算總黃酮的提取得率。

總黃酮提取得率=[（C×V×n）/m ]×100%，其中C由回歸方程計算出總黃酮濃度（mg/mL）;V為濃縮液定容體積（mL）;n為表示稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量。

1.2.2單因素試驗。

1.2.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響。

固定料液比為1∶30（g∶mL），20%功率比超聲提取2次，每次提取5 min，考察乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）對黃荊葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.2提取次數(shù)對總黃酮得率的影響。

固定1∶30料液比加入50%乙醇，20%功率比超聲5 min，考察提取次數(shù)（1、2、3、4次）對黃荊葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.3料液比對總黃酮得率的影響。

固定乙醇50%，20%功率比超聲提取2次和每次提取5 min，考察料液比（1∶1、 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）對黃荊葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.4超聲功率對總黃酮得率的影響。

固定1∶30料液比加入50%乙醇和超聲提取2次，考察超聲功率比（20%、40%、60%、80%、100%）每次提取5 min，對黃荊葉總黃酮提取率的影響。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2019年

1.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化黃荊葉總黃酮提取工藝。

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行試驗結(jié)果分析，選用提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度、超聲功率等4個影響因素為自變量，以黃荊葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗方案，進(jìn)行黃荊葉總黃酮提取工藝優(yōu)化。

1.2.4一年中4—11月黃荊葉總黃酮含量的變化規(guī)律。

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，采用黃荊葉最佳提取工藝，提取4—11月黃荊葉總黃酮，明確4—11月份中黃荊葉總黃酮的含量變化規(guī)律。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對黃荊葉總黃酮得率的影響。

在固定提取次數(shù)、超聲功率和料液比的條件下，乙醇濃度對黃荊葉總黃酮得率的影響見圖1。從30%增加到50%時，總黃酮得率最大，故選擇乙醇濃度為50%。

2.1.2提取次數(shù)對黃荊葉總黃酮得率的影響。

在固定乙醇濃度、超聲功率和料液比的條件下，提取次數(shù)對黃荊葉總黃酮得率的影響見圖2。隨著提取次數(shù)的增加，黃荊葉總黃酮提取得率呈先增加后平緩的趨勢，當(dāng)提取次數(shù)為3次時，總黃酮提取得率達(dá)到最大值，故選擇提取次數(shù)為3次。

2.1.3料液比對黃荊葉總黃酮得率的影響。

在固定提取次數(shù)、超聲功率和乙醇濃度的條件下，料液比對黃荊葉總黃酮得率的影響見圖3。在一定料液比范圍內(nèi)隨著料液比的增大，黃荊葉總黃酮類成分的溶出量不斷增加，當(dāng)料液比為1∶50時，黃荊葉總黃酮得率達(dá)到最大值，隨后下降，故選擇料液比為1∶50。

2.1.4超聲功率比對黃荊葉總黃酮得率的影響。

在固定提取次數(shù)、料液比和乙醇濃度的條件下，超聲功率比對黃荊葉總黃酮得率的影響見圖4。隨著超聲功率比的增加，黃荊葉總黃酮提取得率呈先升高后下降趨勢，當(dāng)超聲功率比為40%時，總黃酮的提取得率達(dá)到最大值，故選擇超聲功率比為40%。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.2.1試驗方案及結(jié)果。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面試驗方案，進(jìn)行黃荊葉總黃酮提取工藝優(yōu)化。中心組合設(shè)計的因素與水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

2.2.2黃酮得率回歸模型的建立和方差分析。

以黃荊葉總黃酮得率為響應(yīng)值的線性回歸方程為Y=10.47+0.12A-0.13B+0.18C+4.283E-003D+0.37AB+0.15AC+0.12AD+0.081BC-0.14BD+0.37CD-1.07A2-1.40B2-1.00C2-1.05D2。

模型分析結(jié)果表明，模型F=16.40（P<0.000 1），回歸模型極顯著。失擬項P=0.034 3（P<0.05），失擬項顯著，對試驗擬合性較差。R2=0.999 9，模型擬合程度較好。顯著性檢驗表明，乙醇濃度、提取次數(shù)、超聲功率比、料液比對黃荊葉總黃酮得率的影響不顯著，影響順序為超聲功率比>提取次數(shù)>乙醇濃度>料液比。乙醇濃度與提取次數(shù)的交互項AB和超聲功率比與料液比的交互項CD的P值均小于0.05，表明乙醇濃度與提取次數(shù)和超聲功率比與料液比的交互作用對黃荊葉總黃酮得率有顯著影響。乙醇濃度的二次項A2、提取次數(shù)的二次項B2、超聲功率比的二次項C2和料液比的二次項D2對黃荊葉總黃酮的得率都有極顯著的影響（P<0.001）。

2.2.3響應(yīng)曲面分析。

兩兩因素的交互作用對黃荊葉總黃酮得率影響的響應(yīng)面分析見圖5。

由圖5可見，乙醇濃度、提取次數(shù)對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面變化陡峭，其等高線稀疏呈橢圓形，且橢圓弧度較大，表明乙醇濃度與提取次數(shù)的交互作用顯著，兩者對黃荊葉總黃酮得率的影響明顯。

乙醇濃度、超聲功率比對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面變化較平緩，其等高線較密集呈微橢圓形，表明乙醇濃度與超聲功率比的交互作用不顯著，兩者對黃荊葉總黃酮得率的影響較小。

乙醇濃度、料液比對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面較為平緩，其等高線較密集呈圓形，表明乙醇濃度與料液比的交互作用不顯著。

提取次數(shù)、超聲功率比對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面較為陡峭，其等高線呈近圓形，表明提取次數(shù)與超聲功率比的交互作用不顯著。

超聲功率比、料液比對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面陡峭，且其等高線呈橢圓形，表明超聲功率比與料液比的交互作用顯著，兩者對黃荊葉總黃酮得率的影響顯著。

提取次數(shù)、料液比對應(yīng)的響應(yīng)面3D圖曲面較陡峭，其等高線稀疏且呈近圓形，表明提取次數(shù)與液料比的交互作用不顯著。

通過響應(yīng)面優(yōu)化，最終確定提取黃荊葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度為50.59%，提取次數(shù)為2.96次，超聲功率比為41.94%，料液比為1.00∶50.25，總黃酮含量理論值應(yīng)為10.482 4%。為方便操作，最終黃荊葉藥材以1∶50的比例與51%乙醇混合后在40%超聲功率比下提取3次。

2.3驗證試驗

按優(yōu)化后工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗，測得黃荊葉總黃酮的平均得率為10.485 8%，與理論值基本一致。

2.4黃荊葉總黃酮一年內(nèi)月周期變化規(guī)律

采用優(yōu)選的最佳提取方案進(jìn)行4—11月份黃荊葉總黃酮含量的提取，從圖6可以看出，4—8月份總黃酮含量一直在增加，8月份的黃荊葉總黃酮含量達(dá)到最高，為11.223 5%;9月份后開始下降，特別是11月份總黃酮含量急劇下降，主要是因為10月份后氣溫下降，黃荊葉不再生長，11月15日時黃荊葉開始枯黃脫落。

3結(jié)論與討論

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選擇乙醇濃度、提取次數(shù)、超聲功率比、料液比4個考察因素，設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面分析法，確定提取黃荊葉總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果得出最佳提取工藝：乙醇濃度為51%，提取次數(shù)為3次，超聲功率比為40%，料液比為1∶50，黃荊葉總黃酮得率的理論值達(dá)10.482 4%。3次驗證試驗所得的黃荊葉總黃酮得率為10.485 8%，與理論值基本一致。

利用最佳提取工藝提取4—11月的黃荊葉總黃酮，發(fā)現(xiàn)

黃荊葉總黃酮變化的基本規(guī)律，隨著黃荊葉的生長，總黃酮含量在不斷增加，在8月份黃荊葉基本不再長大時總黃酮含量也達(dá)到最高（11.223 5%），以后隨著黃荊葉的逐漸老化，總黃酮含量葉逐漸減少，在11月黃荊葉枯萎發(fā)黃要脫落時，總黃酮的含量急劇下降，這也為開發(fā)利用黃荊葉總黃酮提供了理論依據(jù)，在采集黃荊葉時應(yīng)該以8月份為最佳采收期，這個時間段黃荊葉的產(chǎn)量高，黃酮含量也最高，枯萎落地的葉片含總黃酮低，所以不能收集落地的葉片作為藥材。

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