譚德冠 彭晶 韓冰瑩 付莉莉 孫雪飄 張家明

摘 ?要??橡膠樹乳管分化研究主要以樹皮為研究材料。本研究通過組織化學染色法、尼羅紅熒光染色法、免疫組織化學法和分子生物學方法證實橡膠樹葉柄來源的愈傷組織中存在乳管細胞。乳管細胞在葉柄愈傷組織中隨機分布，分布模式類似橡膠樹初生乳管;葉柄愈傷組織乳管細胞在發(fā)育早期時橡膠粒子較少，在發(fā)育后期時充滿橡膠粒子。RT-PCR擴增出葉柄愈傷組織乳管細胞的橡膠延伸因子（REF）、小橡膠粒子蛋白（SRPP）、橡膠凝集素（hevein）和橡膠轉移酶（CPT）等膠乳特異基因的轉錄本，經比對它們序列與所報道的橡膠樹樹干膠乳中表達的基因序列一致，表明橡膠樹葉柄愈傷組織乳管細胞擁有樹皮乳管細胞相似的功能，為葉柄愈傷組織作為一種新型的研究乳管分化的模式提供了科學依據。

關鍵詞 ?橡膠樹;葉柄愈傷組織;乳管細胞;乳管分化;研究模式中圖分類號??Q949.748.5??????文獻標識碼??A

Histochemical and Molecular Characterization of Laticifer Cells in Calli Derived from Petioles of Rubber Tree

TAN Deguan， PENG Jing， HAN Bingying， FU Lili， SUN Xuepiao， ZHANG Jiaming^*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Biology and Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The trunk bark of rubber tree （Hevea brasiliensis） is usually used as the material for the study of laticifer differentiation. In this study， we confirmed the presence of laticifer cells in petiole-derived calli by histochemical staining， nile red fluorescence staining， immunohistochemistry and molecular biology. Laticifer cells in petiole-derived calli were distributed randomly， similar to the primary laticifers. They contained less rubber particles in the early developmental stage， and were full of rubber particles in the late developmental stage. The laticifer-specific genes including REF， SRPP， Hevein and CPT were confirmed to be expressed from the petiole-derived callus by RT-PCR， and their transcripts were the same as those reported in the latex of the trunk barks. These results indicated that the laticifer cells in the petiole-derived calli and in barks had similar functions， which would provide a basis for petiole-derived callus as a novel research model to study laticifer differentiation in the rubber tree.

Keywords ?rubber tree （Hevea brasiliensis）; petiole-derived calli; laticifer cells; laticfer differentiation; research model

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.011

乳管是一種高度特化的細胞，是植物貯存和合成膠乳的場所。全球共有22個屬12?500種植物含有乳管細胞，但只有橡膠樹來源的膠乳才具有商業(yè)開發(fā)價值^[1]。橡膠樹是一種重要的熱帶經濟林木，由于其膠乳具有產量高、易收集等優(yōu)勢，占全球天然橡膠的產量99%^[2]。乳管細胞的數量與橡膠樹的產量正相關^[3]，因此研究如何促進乳管細胞分化從而提高橡膠樹的產量是橡膠樹科研人員的重要課題。目前橡膠樹乳管分化的研究主要以樹皮為研究模式，但樹皮模式易受大田環(huán)境（溫度、光照、土壤等）的影響，實驗重復性差;且從種植至開割需7年之久，研究周期長。這些客觀原因導致乳管分化的研究進展緩慢。

Tan等^[4-5]發(fā)現來源于花藥的愈傷組織存在乳管細胞，并提出了花藥愈傷組織可作為一種研究乳管分化的新模式?；ㄋ幱鷤M織模式具有環(huán)境條件可控制、實驗周期短、重復性好的優(yōu)勢，可克服樹皮乳管模式的缺點。但由于橡膠樹一年只有3次花期（春花、夏花、秋花），且每次雄花花期為15?d左右^[6]，導致采用花藥愈傷組織模式研究乳管分化受采樣時間的限制。橡膠樹的枝條頂端被剪后，10?d左右新的幼嫩枝條就會從其腋芽中抽出。因此采用橡膠樹幼嫩的葉柄作為外植體來誘導愈傷組織不受采樣時間的限制。然而目前尚不清楚葉柄來源的愈傷組織中是否也存在乳管細胞。本研究通過組織化學法、尼羅紅熒光染色法、免疫組織化學法和分子生物學法驗證葉柄愈傷組織中是否存在乳管細胞，為葉柄愈傷組織能否作為研究乳管分化的新模式提供科學依據。

1??材料與方法

1.1材料

采用橡膠樹品種熱研7-33-97盆栽芽接苗，種植于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所溫室。去除枝條頂端，10 d后采集從腋芽中新抽出的處于古銅期枝條的葉柄作為外植體。

1.2方法

1.2.1??葉柄愈傷組織的誘導??將幼嫩的葉柄剪成3?cm長，于超凈工作臺中70%酒精消毒1?min，0.15%升汞消毒10?min，無菌水清洗5遍。將消毒好葉柄切成1?cm小段，接種于愈傷誘導培養(yǎng)基中。基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，附加2，4-D 2 mg/L、 NAA 0.5?mg/L、6-BA 1 mg/L、蔗糖80 g/L和植物凝膠2.5?g/L，pH調整至6.0。在黑暗條件下25?℃培養(yǎng)80?d。

1.2.2 ?組織化學染色法??組織化學染色法參照田維敏等^[7]介紹的方法進行。分別將10齡的熱研7-33-97樹干樹皮、枝條樹皮和培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊室溫條件下于80%酒精固定2?d，將固定好的材料經酒精系列脫水，冰醋酸過渡4?h，60?℃下溴-碘溶液（冰醋酸100?mL，碘5?g，溴液0.4 mL）處理42?h。溴-碘溶液處理后的材料經正丁醇透明，石蠟包埋與切片，切片厚度10??m片。經二甲苯浸泡切片2次，后用固綠溶液（1 g固綠溶于100 mL 95%酒精）染色，光學顯微鏡下觀察切片。

1.2.3 ?尼羅紅熒光染色法??尼羅紅熒光染色法參照Sando等^[8]報道的方法進行。將培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊切成1?mm×1?mm的小塊，80%酒精固定6?h，1 mol/L鹽酸60?℃水浴鍋中處理18 min，6000?g離心5min后棄除上清，ddH₂O清洗愈傷細胞2次，每次3?min，6000?g離心5?min收集愈傷細胞。將處理好后的愈傷細胞浸于50??g/mL的尼羅紅溶液（Sigma）中10?s，ddH₂O清洗2次，將愈傷細胞均勻涂布于載玻片上，指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察，紫外光波長為420～490?nm。

收集10齡的熱研7-33-97膠乳于冰浴的離心管中，加入4倍體積的含等滲液（10?mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L蔗糖，pH?7.0）的尼羅紅溶液（50??g/mL）處理10 s，12?000?g離心10?min后收集上層漂浮物，等滲液清洗2次，將處理后的膠乳物質均勻涂布于載玻片上，指甲油封片，于熒光顯微鏡下420～490 nm觀察。

1.2.4 ?免疫組織化學法??免疫組織化學法參照Tan等^[4]報道的方法進行。將固定好的80?d葉柄愈傷組織塊進行石蠟包埋切片，切片脫蠟后復水，置于0.01?mol/L檸檬酸鈉緩沖液中于95?℃下處理15?min來修復抗原，PBS清洗3次，2%牛血清蛋白處理30?min。加入一抗[兔抗小橡膠粒子蛋白（SRPP）抗體，或兔抗橡膠延伸因子蛋白（REF）抗體]（兔抗SRPP、兔抗REF由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所王旭初課題組提供）（按1∶100稀釋）于切片中，將切片置于密封的培養(yǎng)皿中4?℃下孵育過夜。PBS清洗3次，加入二抗（羊抗兔，螯合堿性磷酸酶），37?℃孵育1?h，PBS清洗5次。切片用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液處理5?min，PBS清洗5次，酒精系列脫水，二甲苯透明，封片后在光照顯微鏡下觀察。

1.2.5??RT-PCR擴增葉柄愈傷組織中乳管特異表達基因??取培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取其RNA，第一鏈cDNA采用反轉錄cDNA試劑盒（Fermentas）進行合成。橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（small rubber particle protein，SRPP）和橡膠轉移酶（cis-prenyl transferase，CPT）基因是橡膠樹乳管細胞特異表達的與膠乳合成相關的基因^[9-11];橡膠凝集素（Hevein）是膠乳中最豐富的蛋白，具有防御等功能^[12]。通過NCBI網上查詢，獲得了該4個基因在橡膠樹樹皮膠乳的cDNA序列。它們在GenBank的登錄號分別為HQ640230、HQ640231、EU675683和AY247790。根據它們的序列應用DNAMan軟件設計相應的擴增引物，其中REF-F：5′-GAAGACGA AGACAACCAAC AA G?-3′，REF-R：5′-AAGCCAGAAAACGAGCAG-3′;SRPP-F：5′-GGCTGAAGAGGTGGAGGA-3′，SRPP?-R：5′-GGGCAACAAAGGCAAATA-3′;CPT-F：5′-AAGGTCCCATCCCTACTCAT-3′，CPT-R：5′-?T AGACGGCTCAACCCAGA-3′;Hevein-F：5′-A TAACCTATGTTGTAGCCAGTG-3′，Hevein-R：5′- TGACCTCGTTCATATCCTTT-3′。PCR產物經DNA純化試劑盒（寶生物）純化后送至華大基因測序，對測序結果進行Blast比對。

2??結果與分析

2.1組織化學法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細胞

溴-碘組織化學染色法是一種經典的鑒定植

物乳管細胞的方法，乳管細胞的內含物被染成棕紅色，易于鑒別，被廣泛應用于橡膠樹樹皮乳管分化研究中^[13]。本研究采用該方法對10齡的熱研7-33-97樹干樹皮及其枝條的樹皮進行染色，發(fā)現樹皮中的乳管細胞的內含物均被染成棕紅色（圖1A，圖1B）。成齡樹樹干樹皮與枝條樹皮的乳管細胞存在分布上的差異，前者來源于形成層的次生分生組織，為次生乳管^[14]，在韌皮部中成列分布，不同的乳管列之間相互平行（圖1A）;而后者來源于頂端分生組織，為初生乳管^[14]，在組織中隨機分布（圖1B） 。

葉柄在愈傷組織誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)80?d后，其所分化出的愈傷組織為鮮黃色，質地緊密，表面有些顆粒狀小突起（圖1C）。對該愈傷組織進行溴-碘組織化學染色，顯微鏡下觀察到一些呈棕紅色的細胞（圖1D），表明這些細胞為乳管細胞。愈傷組織中乳管細胞的顏色較次生乳管顏色深，而與初生乳管細胞顏色相近;其分布是隨機的，有些乳管細胞相聚在一起，但大部分乳管細胞是單個的（圖1D），與初生乳管分布方式相近。愈傷組織存在單寧細胞，經溴-碘染色后變?yōu)楹谏?

同時還存在淀粉細胞，該細胞內含有較多的淀粉粒（圖1D）。部分愈傷組織乳管細胞的內含物收縮明顯，聚集于乳管細胞的中央處，這可能是在制片過程中經各種試劑處理，膠乳變性收縮所造成的。

2.2 尼羅紅熒光染色法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細胞

橡膠樹的乳管細胞主要含有橡膠粒子、黃色體、F-W復合體、線粒體等，乳管被開割后，這些物質從乳管細胞中流出，形成膠乳^[15]。其中橡膠粒子是膠乳的主要成分，1?mL膠乳中含有4.7×?10¹³個橡膠粒子^[16]。在可見光下，膠乳中的橡膠粒子為極小的顆粒，經尼羅紅染色后，在熒光條

件下橡膠粒子呈現為黃色的小顆粒（圖2A）。葉柄愈傷細胞經1?mol/L鹽酸的處理后，通過尼羅紅熒光染色法發(fā)現一些細胞中有黃色小顆粒（圖2B），表明該細胞含有橡膠粒子，應為乳管細胞。同時也發(fā)現愈傷組織中存在管狀的乳管（圖2C），是由多個相鄰乳管細胞相互融合貫通形成的，乳管細胞融合貫通后所形成的乳管充滿了橡膠粒子，尼羅紅染色后在熒光條件下整個乳管呈現黃色（圖2C）。圖2B中的乳管細胞為乳管細胞發(fā)育早期，所含的橡膠粒子較少，而圖2C中的相互融合貫通的乳管細胞為乳管細胞發(fā)育的晚期，乳管細胞內充滿了橡膠粒子，這也表明乳管細胞發(fā)育的過程是個橡膠粒子不斷形成增多的過程。

2.3免疫組織化學法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細胞

橡膠樹乳管細胞含有特異的SRPP和REF。石蠟切片的葉柄愈傷組織經含有兔抗SRPP或REF的一抗處理后，再與螯合有堿性磷酸酶顯色基團的羊

抗兔二抗相結合，經BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液顯色后，觀察到染成藍黑色的細胞，為含有SRPP和REF的細胞。由于SRPP和REF在乳管細胞中特異表達，因此藍黑色細胞為乳管細胞，其內含物收縮明顯;而非乳管細胞沒有被染上顏色（圖3）。

2.4 ?RT-PCR擴增葉柄愈傷組織膠乳特異基因

在本研究中，REF、SRPP、Hevein和CPT基因片段均能從橡膠樹葉柄愈傷組織的cDNA中擴增出來，RT-PCR產物經測序后分別為355、571、439、653 bp（圖4）。對測序結果進行Blast比對，發(fā)現從葉柄愈傷組織中所擴增出來的4個膠乳特異基因的轉錄本序列與所報道的橡膠樹樹皮膠乳中表達的基因序列一致，進一步從分子水平證實了葉柄愈傷組織存在乳管細胞，且這些乳管細胞與樹皮乳管細胞功能相似。

3??討論

溴-碘染色的組織化學法可使植物組織中乳管細胞的橡膠變成不溶于二甲苯的棕紅色物質，從而鑒定出乳管細胞^[13]。尼羅紅染色熒光法通過尼羅紅染料與脂類物質相結合而發(fā)出熒光檢測信號，植物乳管細胞的膠乳含有脂類物質，可通過該方法來鑒定植物乳管細胞^[8]。但橡膠樹愈傷組織細胞具有自發(fā)的熒光物質^[17]，如果直接采用尼羅紅熒光染色法來鑒定葉柄愈傷組織中乳管細胞，勢必會有背景熒光的假陽性干擾。本研究用1?mol/L鹽酸60?℃條件下處理葉柄愈傷組織細胞，發(fā)現能夠去除愈傷組織細胞的自發(fā)熒光物質，同時發(fā)現橡膠粒子與尼羅紅染料結合，在紫外光條件下橡膠粒子顯示黃色熒光。免疫組織化學法利用抗原與抗體具有高度特異性結合的特點，通過化學反應使標記抗體的顯色基團顯示出來，從而確定組織細胞的抗原，并對其進行定性、定位和定量研究^[18]。本研究利用SRPP或REF的特異一抗處理愈傷組織細胞，愈傷組織中的乳管細胞的底物SRPP或REF與一抗特異結合，再經含顯色基團的二抗處理，經顯色處理后乳管細胞呈現藍黑色。本研究綜合上述3種方法來鑒定葉柄愈傷組織乳管細胞，為證實葉柄愈傷組織存在乳管細胞提供了依據。

在本研究中葉柄愈傷組織的乳管細胞分布模式與Tan等^[4]報道的花藥愈傷組織乳管細胞的相一致，均為隨機分布，表明兩者分化方式相似。葉柄含有乳管細胞，以其為外植體所誘導出的愈傷組織的乳管細胞的來源尚不清楚，可能來源于愈傷組織中的薄壁細胞，也可能來源于葉柄乳管細胞，因此需對葉柄愈傷組織中乳管細胞的整個發(fā)育過程進行系統研究。

REF、SRPP、CPT是存在于小橡膠粒子膜的蛋白質，是參與橡膠樹橡膠合成的重要酶和調控因子^[9-11]。Hevein存在于橡膠樹黃色體中，乳管被開割后黃色體破裂被釋放出來，具有凝固膠乳和防御病原菌的功能^[12]。本研究從葉柄愈傷組織中擴增出該4個膠乳特異表達基因的轉錄本，且發(fā)現它們的序列與樹皮乳管細胞的相一致，表明葉柄愈傷組織乳管細胞與樹皮乳管細胞功能相似，這為葉柄愈傷組織作為研究乳管分化的新模式提供了科學依據。

致謝中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所王旭初課題組為本研究提供兔抗SRPP抗體、兔抗REF抗體，特此致謝！

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