周新華，曾平生，武曉玉，姚甲寶，熊光康，李家彧

（中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心，江西 分宜 336600）

遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，它體現(xiàn)了物種基因的豐富程度，是研究物種多樣性及生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎[1-2]。生物種內(nèi)遺傳多樣性研究有多種遺傳標記方式，包括表型、細胞學、生化和分子標記4 大類，表型相較于其他三種方式可以更直觀地揭示生態(tài)系統(tǒng)多樣性和生物多樣性[3-5]。生物的表型變異是基因在環(huán)境因子的影響下不同表達的結(jié)果，是生物的遺傳受制于環(huán)境條件的遺傳表征是遺傳多樣性的主要研究內(nèi)容[6]。利用表型性狀研究種群的遺傳多樣性具有簡便、快速和節(jié)省費用等優(yōu)點，盡管表型性狀不完全等同于基因位點，但表型變異是基因型與環(huán)境因子共同作用的結(jié)果，更具有綜合性和實用性[7]。目前，國內(nèi)外學者在表型變異研究方面已在木本植物、藤本植物和草本植物[8-23]開展了相關(guān)研究，為相關(guān)植物資源的保護利用或遺傳育種奠定了堅實的基礎。

多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua 屬百合科黃精屬的多年生草本植物，是藥食兩用的大宗傳統(tǒng)中藥材，具有較高的觀賞、藥用和經(jīng)濟價值[24-25]。多花黃精主要分布在貴州、湖南、四川、湖北、河南、浙江、廣東、福建、安徽、江西等南方省份，生長在海拔500～2 100 m 的林下、灌叢或山坡陰處[25]。多花黃精植株形態(tài)優(yōu)美，根莖含有特有的黃精多糖、皂苷等藥用活性物質(zhì)，故在生產(chǎn)實踐中可用作園林綠化草本植物，也是當今林下經(jīng)濟發(fā)展中重要的林下藥材栽培品種。然而，多花黃精之前的研究主要集中在種子的萌發(fā)[26]、無性組培育苗[27-30]、塊莖藥用成分分析[31-32]和人工林下栽培[33-35]等方面，但作為遺傳育種工作基礎的地理種源、群落和形態(tài)變異暫未見相關(guān)研究報道。以不同地理種群的野生多花黃精為研究對象，從全國分布區(qū)內(nèi)選取了具有代表性的9 個樣點，系統(tǒng)測定與其生長表型形狀密切相關(guān)的12 個性狀，運用統(tǒng)計學分析方法分析其相關(guān)指標，闡明不同地理種群間及其自身內(nèi)部的變異規(guī)律，為多花黃精中藥材產(chǎn)業(yè)利用、開發(fā)和保護提供支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和數(shù)據(jù)收集

在對中國植物志、中國數(shù)字植物標本館等文獻資料檢索和野外實地調(diào)查的基礎上，作者于2014—2017年的10—11月間進行多花黃精植株的野外收集工作。野生植株的收集地點分別位于江西省的鷹潭市（JXYT）、新余市（JXXY），湖北省的宜昌市（HBYC），浙江省的麗水市（ZJLS），安徽省的黃山（AHHS），貴州省的凱里市（GZKL），廣西省的桂林市（GXGL），湖南省的衡陽市（HNHY），四川省的南充市（SCNC），共計9個地理種群的135 株。植株收集要求生長年限5 a以上，單株無病蟲害，生長態(tài)勢正常，無明顯的缺陷，同時每個地理種源收集的單株要求間隔距離大于30 m 以上，種群保有單株數(shù)量在100 株以上。由于野生多花黃精生長在原生環(huán)境較好的高山蔭蔽處，植株收集工作比較困難，故植株收集時要求盡可能多地收集多花黃精單株，9 個種群的植株收集數(shù)量至少保證每個種群在15 株以上。通過查閱中國自然資源數(shù)據(jù)庫（http://www.data.ac.cn/zy/show/shi3.asp）獲得相關(guān)調(diào)查區(qū)域的氣候資源數(shù)據(jù)，并在調(diào)查時記錄各點的地理經(jīng)緯坐標和海拔等數(shù)據(jù)，所獲得數(shù)據(jù)具體見表1。

表1 野生多花黃精9個種群的地理位置及主要氣候因子Table 1 Geographical locations and main conditions for nine populations of Polygonatum cyrtonema

1.2 表型性狀測定方法

每個種群選取長勢良好的健康單株5 株，統(tǒng)計其葉片數(shù)，并利用電子游標卡尺測定每株的葉長、葉寬、地徑、果實縱徑、果實橫徑，測量時精確到0.01mm，計算葉片的長寬比和果實的橫縱比；利用LI-3000C 便攜式葉面積測定儀（LI-COR，Lincoln，USA）測定每株每片葉的葉面積，并計算其全株葉面積，測量精確到0.01 cm2；利用不銹鋼直尺測定每株株高，測量精確到0.1 cm，每個野生種群測量5 株，重復3 次，每個單株的葉長、葉寬、葉柄長、果實縱徑、果實橫徑、葉面積等指標按單株取平均值。每個種群隨機選取100 粒種子，帶回實驗室用電子分析天平測定其質(zhì)量，換算成千粒重，重復5 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的整理和統(tǒng)計分析采用社會統(tǒng)計學分析軟件SPSS25.0 進行。對所選取的12 個表型形狀指標進行9 個地理種群間的單因素方差分析和多重比較分析，比較表型分化系數(shù)等得出種間表型性狀變異特征[36]；運用表型性狀的平均值和標準差，計算出表型性狀的變異系數(shù)，然后用變異系數(shù)來衡量多花黃精種群內(nèi)的變異水平；運用相關(guān)分析來分析各表型性狀與生態(tài)因子之間的相互關(guān)系；運用聚類分析，計算出不同種群遺傳距離的大小。所有數(shù)據(jù)在統(tǒng)計分析時，均確保在同一量綱上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生多花黃精生長表型在種群間和種群內(nèi)的變異

野生多花黃精生長表型指標在種群間和種群內(nèi)的差異結(jié)果見表2。分析結(jié)果可知，所選取的12 個表型性狀除果實橫縱比外，其余性狀指標無論是在種群間還是種群內(nèi)都存在顯著（P ＜0.05）或極顯著（P ＜0.01）的差異，這就說明不管是在種群間還是在種群內(nèi)，野生多花黃精大部分生長表型性狀指標存在變異。9 個不同種群的12 個生長表型性狀指標的平均值、標準差及多重比較結(jié)果（表4）表明，除果實橫縱比外的各表型性狀間均存在顯著差異。其中，江西新余種群的葉片寬最小、葉片長寬比最大，其值分別為30.19 mm 和5.60，與其它幾個種群間的差異較為顯著；湖北宜昌種群的果實橫徑最小，其值為6.88 mm，與四川南充種群間差異極顯著；浙江麗水種群的葉片數(shù)、葉片長寬比、全株葉面積、地徑和株高值最小，其值分別為10.67、3.08、364.61 cm2、4.56 mm 和57.11 cm，葉片寬值最大，其值為37.56 mm；安徽黃山種群的葉片長、葉面積和全株葉面積值最大，其值分別為178.99 mm、49.43 cm2和897.33 cm2，果實縱徑值最小，其值為6.28 mm；貴州凱里種群的葉片數(shù)、株高最大，其值分別為20.67、105.00 mm，顯著大于江西鷹潭、江西新余、浙江麗水和廣西桂林種群；湖南衡陽種群的葉片長、葉面積和種子千粒重值最小，其值分別為112.16 mm、27.16 cm2和12.23 g；四川南充種源的地徑、果實橫徑、果實縱徑和種子千粒重均最大，其值分別為10.66 mm、9.76 mm、11.11 mm和16.43 g，均顯著高于大多數(shù)種群。

表2 野生多花黃精各種群間和種群內(nèi)全株、葉片、果實、種子表型性狀的方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of phenptypic traits of whole plant,leaf,fruit and seeds among and within Polygonatum cyrtonema Hua populations

9 個不同種群野生多花黃精的12 個表型性狀指標在種群內(nèi)方差分量、種群間方差分量和分化系數(shù)情況見表3。數(shù)據(jù)顯示：就各性狀的平均方差分量百分比來看，種群內(nèi)占36.24%、種群間占15.37%、隨機誤差占48.39%，種群內(nèi)的平均方差分量百分比遠大于種群間的平均方差分量百分比，這說明生長表型性狀的種群內(nèi)變異遠大于種群間的變異；就各性狀的平均表型分化系數(shù)來看，種群內(nèi)貢獻值是71.16%、種群間貢獻值是28.84%，這就說明在野生多花黃精的表型變異中，種群內(nèi)部的變異遠遠大于種群間的變異，即變異主要存在不同種群內(nèi)部。

2.2 不同地理種群野生多花黃精表型性狀變異特征分析

不同地理種群野生多花黃精的各表型性狀在種群內(nèi)的平均變異系數(shù)為12.16%，變異幅度為4.76%～23.63%（表5）。葉片數(shù)、全株葉面積、地徑、株高和種子千粒重等5 個指標的變異系數(shù)都大于16%，遠超所有指標的變異系數(shù)平均值；葉片長、葉片寬、葉片長寬比、單葉面積、果實縱徑、果實橫徑和果實橫縱比等7 個表型性狀的變異系數(shù)均不超過12.16%。另外，進一步分析不同地理種群野生多花黃精所有指標的平均變異系數(shù)可知，江西新余、浙江麗水和廣西桂林3 個種群的變異系數(shù)較大，其值分別為14.45%、15.99%和19.76%，遠大于平均變異系數(shù)12.16%，這就表明了新余、麗水和桂林種群的表型變異和多樣性均較為豐富；湖南衡陽和四川南充2 個種群的變異系數(shù)較小，其值分別為8.21%和6.39%，遠小于平均變異系數(shù)12.16%，說明這2 個地理種群的表型變異較弱，多樣性也較低；江西鷹潭、湖北宜昌、安徽黃山和貴州凱里4 個種群的變異系數(shù)幅度為10.15%～12.94%，比較接近平均變異系數(shù)12.16%，說明這4 個地理種群的多樣性大體一致。

表3 野生多花黃精表型性狀的方差分量及其種群間表型分化系數(shù)Table 3 Variation components and phenotypic differentiation coefficients among Polygonatum cyrtonema Hua populations

表4 野生多花黃精9個種群表型性狀的平均值、標準差及多重比較Table 4 The mean value,standard deviation and multiple comparison of phenotypic traits of nine populations in Polygonatum cyrtonema Hua

表5 野生多花黃精種群表型性狀變異系數(shù)Table 5 Variation coefficients of phenotypic traits in Polygonatum cyrtonema Hua populations

表6 野生多花黃精13個表型性狀與生態(tài)地理因子的相關(guān)系數(shù)Table 6 The correlation coefficient of Polygonatum cyrtonema Hua 13 phenotypic traits and geographical factor

2.3 不同野生多花黃精種群表型性狀的地理變異

野生多花黃精全株、葉片、果實和種子12 個表型性狀與采集地點的生態(tài)地理因子的相關(guān)分析見表6。葉片數(shù)、地徑、株高、果實縱徑和種子千粒重與經(jīng)度均呈現(xiàn)顯著或極顯著的負相關(guān)關(guān)系，說明在經(jīng)度較高的地區(qū)多花黃精擁有更少的葉片數(shù)，更小的地徑、株高、果實縱徑和種子千粒重；葉片寬與緯度間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明隨著緯度的增大葉片寬呈現(xiàn)下降趨勢；葉片長、葉片長寬比和全株葉面積年平均溫度間呈現(xiàn)顯著或極顯著的負相關(guān)關(guān)系，果實縱徑與年平均溫度呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明溫度越低葉片長、葉片長寬比和全株葉面積越大，果實縱徑越小；葉片長、葉面積和全株葉面積與1月平均溫度呈現(xiàn)極顯著的負相關(guān)關(guān)系，說明1月份平均溫度越高，葉片長、葉面積和全株葉面積越?。蝗~片長和葉面積與無霜期呈現(xiàn)顯著或極顯著的負相關(guān)關(guān)系，說明無霜期越長，葉片長和葉面積越小。12 個表型性狀均與海拔、7月平均溫度、年日照時數(shù)和年降水量無顯著相關(guān)關(guān)系，說明這些地理生態(tài)因子對多花黃精表型性狀的影響不大。

2.4 不同地理種群野生多花黃精表型的聚類分析

利用所選取的12 個表型形狀，采用歐氏距離法對9 個野生多花黃精種群進行聚類分析，聚類結(jié)果見圖1。從種群關(guān)系聚類樹狀圖可以看出，9 個野生多花黃精種群明顯可以分為3類，江西鷹潭、廣西桂林、湖南衡陽和四川南充種群歸為第Ⅰ類，江西新余和浙江麗水種群歸為第Ⅱ類，河北宜昌、貴州凱里和安徽黃山種群歸為第Ⅲ類。仔細分析發(fā)現(xiàn)，在地理分布上相近的種群反到?jīng)]有能聚為一類，因此，筆者將9 個野生多花黃精種群的12 個表型性狀的Eucidean distances 與地理距離進行相關(guān)分析，相關(guān)分析數(shù)據(jù)顯示歐氏距離與地理距離之間的相關(guān)性不顯著（R=0.162，P=0.421）。這可能與野生多花黃精的自然生長環(huán)境有關(guān)，多花黃精喜歡陰涼、潮濕的生長環(huán)境，一般分布在林下、灌木下和山坡陰處，這種選擇性的生長環(huán)境與地理位置的連續(xù)改變引起的生境改變相關(guān)系不大。這說明小生境的影響大于大氣候?qū)Χ嗷S精表型變異的影響。

圖1 基于12 個表型性狀的野生多花黃精種群關(guān)系樹狀圖Fig.1 Dendrogram of wild Polygonatum sibiricum population based on 12 phenotypic traits

3 討 論

3.1 不同地理種群野生多花黃精表型變異來源

通過對野生多花黃精9 個地理種群的葉片數(shù)、葉片長、葉片寬、葉片長寬比、單葉面積、全株葉面積、地徑、株高、果實縱徑、果實橫徑、果實橫縱比和種子千粒重等12 個表型性狀的深入研究可以發(fā)現(xiàn)，野生多花黃精的這些表型性狀除果實橫縱比外的性狀均在種群間和種群內(nèi)存在顯著或極顯著的差異，這與紫茉莉[36]、肉蓯蓉[37]、丹參[38]、黃芩[39]等藥用植物的研究結(jié)果相似，這是不同地理種群的野生多花黃精自身遺傳基因和所處生態(tài)環(huán)境共同作用的結(jié)果。種群間表型分化研究結(jié)果表明，種群內(nèi)的變異遠大于種群間的變異，種群內(nèi)的變異是野生多花黃精表型變異的主要來源。12 個表型性狀的變化幅度為17.19%～44.41%，平均分化系數(shù)為28.84%，種群間的變異僅貢獻28.84%，遠遠小于種群內(nèi)的變異貢獻71.16%，引起這一現(xiàn)象的原因可能有兩個：其一是9 個野生多花黃精種群在地理分布上相隔距離較遠，除江西新余和江西鷹潭種源是同一個省份的，相隔距離為200 km 左右，其它種群均分布均在不同省份，相隔距離均大于江西新余和鷹潭的距離，這就導致不同種群間在基因交流時受阻于距離；另一個原因是同一種群的野生多花黃精生長在同質(zhì)的生境條件下，這樣就導致了同一種群內(nèi)的多花黃精分布較為集中，種群內(nèi)部的基因交流就相對容易實現(xiàn)。因此，基于上述原因，野生多花黃精種群內(nèi)的遺傳分化較種群間的遺傳分化更容易實現(xiàn)，這就說明了多花黃精表型變異主要來源于種群內(nèi)部。

3.2 不同地理種群野生多花黃精表型變異特征

變異系數(shù)又稱離散系數(shù)，是衡量測量值變異程度的一個統(tǒng)計量，其值越大，則測量值的變異程度也就越大，則對應的物種多樣性也就越豐富。對9 個野生多花黃精種群的葉片數(shù)、葉片長、葉片寬、葉片長寬比、單葉面積、全株葉面積、地徑、株高、果實縱徑、果實橫徑、果實橫縱比和種子千粒重等12 個表型性狀的變異系數(shù)深入研究發(fā)現(xiàn)，所有表型性狀的變異系數(shù)幅度在4.76%～23.63%之間，平均變異系數(shù)為12.16%，變異系數(shù)的變化范圍較大，說明多花黃精種群內(nèi)表型性狀的變異程度較高。種群內(nèi)的變異程度也高，則說這一種植物種群內(nèi)可能存在的遺傳變異較大，同時也能更好地適應生存環(huán)境的改變。

野生多花黃精葉片數(shù)、全株葉面積、地徑、株高和種子千粒重等5 個表型性狀的變異系數(shù)分 別 為18.00%、23.63%、16.88%、16.14% 和14.75%，遠大于平均變異系數(shù)，這5 個指標的穩(wěn)定性排名為種子千粒重＞株高＞地徑＞葉片數(shù)＞全株葉面積，這與滇重樓[40]和蘭州百合[41]的種子、葉片和莖的相關(guān)研究性狀是一致的，這就表明野生多花黃精種子的穩(wěn)定性最高，莖的穩(wěn)定性其次，葉片的穩(wěn)定性最差。

3.3 不同地理種群野生多花黃精表型變異規(guī)律性

植物在不同的生態(tài)環(huán)境中，往往會以不同的形態(tài)來應對以適應，這對提高該物種的抗逆性和適應環(huán)境的能力是非常有利的。以往在許多植物群落的研究中常常會發(fā)現(xiàn)，植物的表型性狀隨生態(tài)地理因子的改變而出現(xiàn)一些規(guī)律性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，緯度、經(jīng)度、年平均溫度、1月平均溫度和無霜期與多花黃精表型性狀間存在一定的顯著相關(guān)性，且而海拔、7月平均溫度、年日照時數(shù)和年降水量與多花黃精表型性狀間無顯著相關(guān)性，這可能與多花黃精特殊喜陰的林下生長環(huán)境有關(guān)。隨著經(jīng)度的增大，野生多花黃精的葉片數(shù)、地徑、株高、果實縱徑和種子千粒重均減小，說明適當經(jīng)度對多花黃精莖葉的營養(yǎng)生長和果種的生殖生長均有明顯的促進作用，這與本次試驗調(diào)查中貴州凱里和四川南充兩個種群莖葉、果實、種子的生長表型情況一致。果實橫徑和果實縱徑與9 個生態(tài)地理因子均無顯著相關(guān)性，這說明生態(tài)環(huán)境因子對多花黃精果實表型的影響不大，而決定果實表型的因素主要是其自身的遺傳因素。

3.4 野生多花黃精保護策略

多花黃精作為我國傳統(tǒng)大宗藥食兩用的藥用植物品種，在人們健康產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展中，傳統(tǒng)制藥、藥膳保健等活動對多花黃精的需求越來越大，使野生多花黃精資源大幅度縮減，導致其種群分布面臨瀕危狀態(tài)。因此，提出并制定相應合理的策略來保護野生多花黃精種質(zhì)資源是十分必要的，具體的保護策略如下：第一，加強對現(xiàn)有野生多花黃精種質(zhì)資源的保護力度，根據(jù)本文的研究結(jié)果，建議將浙江麗水和江西新余遺傳多樣性豐富的種群，設定為重點保護和人工育種單位；第二，加強對野生多花黃精生長環(huán)境的監(jiān)管，對有大面積天然種群分布的林分進行保護，嚴禁破壞其林下生長環(huán)境，為其種群繁衍提供有利條件；第三，在對天然分布種群保護的同時，加大對多花黃精培育的研究，可以選擇優(yōu)良種源進行有性和無性育苗；第四，收集全分布區(qū)野生多花黃精種質(zhì)資源，建立野生多花黃精全分布區(qū)種質(zhì)資源保存圃。