方亞妮,劉金輝,石小玲,戴鵬高

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,陜西 西安 712046;2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710069)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。根據(jù)中國(guó)癌癥流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),2015年我國(guó)確診為肺癌的人數(shù)高達(dá)73.3萬(wàn),發(fā)病率在所有癌癥中占據(jù)首位;肺癌死亡病例為61.0萬(wàn)人,死亡人數(shù)居癌癥首位[1]。近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率也有日益增加的趨勢(shì)。非小細(xì)胞肺癌占肺癌病理類型的80%左右[2],可近一步分為大細(xì)胞癌,鱗狀細(xì)胞癌及腺癌3種類型,其中腺癌患者所占比重最高,50%左右[3]。由于病情的隱匿性,大多數(shù)肺腺癌患者在確診時(shí)已處于晚期,無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療,因此以鉑類藥物為基礎(chǔ)的放化療成為這些患者治療的主要的臨床手段[4],其中順鉑作為化療的一線藥物一直被沿用至今[5]。

然而,患者在長(zhǎng)期使用順鉑過(guò)程中對(duì)其產(chǎn)生的獲得性耐藥使得他們的治療效果大大降低[6]。因此,發(fā)現(xiàn)與順鉑耐藥密切相關(guān)的分子標(biāo)志物對(duì)改善肺腺癌患者的治療現(xiàn)狀有著重大的意義。本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果揭示醛酮還原酶家族1(Aldo-Keto Reductases family 1,AKR1)的3個(gè)成員AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1在A549順鉑耐受株中表達(dá)量顯著提升[7],提示了這3個(gè)基因可能與肺腺癌患者順鉑耐藥相關(guān),但目前尚缺少系統(tǒng)性的研究闡明該家族基因在肺腺癌順鉑獲得性耐藥中的作用。本研究基于抑制劑阻斷,RNAi敲減等細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)對(duì)AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1這3個(gè)基因在肺腺癌順鉑耐藥中的作用進(jìn)行了初步的探究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清,雙抗預(yù)混液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RNA提取試劑Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Real-time qPCR試劑盒One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II購(gòu)買于日本TaKaRa公司。實(shí)時(shí)定量pcr引物和抑制劑Salicylate購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。抑制劑Epalrestat與Medroxyprogesterone acetate購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine?2000購(gòu)自美國(guó)Life technologies公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP由本課題組體外誘導(dǎo)構(gòu)建,耐藥指數(shù)為3.4[7]。A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的雙抗預(yù)混液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。A549/DDP培養(yǎng)在順鉑濃度為2μmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)基中,其他條件相同。A549細(xì)胞和構(gòu)建得到的A549/DDP細(xì)胞首先要經(jīng)過(guò)單克隆篩選以降低遺傳背景對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。將兩種細(xì)胞稀釋到每毫升10個(gè)細(xì)胞,加入96孔板中,每板200μL。培養(yǎng)24h后顯微鏡下觀察,標(biāo)記只有一個(gè)細(xì)胞存活的孔,并對(duì)這些孔進(jìn)行重點(diǎn)觀察,每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)基,待細(xì)胞在孔中富集后將其轉(zhuǎn)移到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng),直至培養(yǎng)得到可以正常繁殖傳代的單克隆A549/DDP和A549細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所提到的A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞均為經(jīng)過(guò)單克隆篩選過(guò)的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將A549/DDP及其親本細(xì)胞A549在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)其表達(dá)量差異進(jìn)行分析比較。我們首先使用Illumina公司的Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,進(jìn)一步基于Cufflinks軟件包對(duì)各轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算,并以A549細(xì)胞為對(duì)照,依照差異倍數(shù)log2|Fold Change|≥2且FDR<0.01的標(biāo)準(zhǔn)篩選兩樣本的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)?；贕O，COG及KEGG 3個(gè)基因功能數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)初步篩選得到的DEGs進(jìn)行了功能注釋及信號(hào)通路富集分析,并結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)深度挖掘和臨床應(yīng)用評(píng)估[7]。

1.4 AKR家族基因差異表達(dá)驗(yàn)證

基于quantitivereversetranscription-PCR(qRT-PCR)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的差異基因AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用TRIzol法提取兩組細(xì)胞總RNA。mRNA反轉(zhuǎn)錄和定量基于One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II提供的試劑完成。所有qRT-PCR實(shí)驗(yàn)均在ABI ViiA7熒光定量平臺(tái)進(jìn)行, 反應(yīng)程序設(shè)置為95℃, 1 min; 95℃,20 s; 60℃, 40 s, 共計(jì)40個(gè)循環(huán), 于60℃收集熒光, 并依據(jù)2Ct內(nèi)參基因-Ct待測(cè)基因計(jì)算各基因的表達(dá)量差異。特異性引物依靠primer-blast在線軟線設(shè)計(jì)完成,選取GAPDH為內(nèi)參基因,見(jiàn)表1。

表1 mRNA定量引物序列Tab.1 Primers sequences used for mRNA expression analysis

1.5 CCK-8法細(xì)胞活性檢測(cè)

CCK-8的主要成分是四唑鹽WST-8,其可在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的甲臜染料(吸收峰為450nm),其生成量與培養(yǎng)孔中活細(xì)胞數(shù)量成正比,故用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)基的在450nm處的吸光值可間接反映出活細(xì)胞的數(shù)目。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,胰酶消化后完成細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)情況將細(xì)胞稀釋到50 000個(gè)/mL,按每孔100μL體積將細(xì)胞懸液加入96孔板中,即每孔接種細(xì)胞數(shù)約為5 000。待細(xì)胞貼壁后將原培養(yǎng)基更換梯度濃度的含藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液,更換為含10%CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育,2h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔細(xì)胞在450nm處的吸光值。吸光值即反映出活細(xì)胞的數(shù)目。

1.6 抑制劑阻斷實(shí)驗(yàn)

本研究使用的3種抑制劑為Salicylate，Epalrestat與Medroxyprogesterone acetate,作用對(duì)象分別是AKR1C1，AKR1B1及AKR1C3。在抑制劑處理之前,為消除原培養(yǎng)基中藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾,首先移除含順鉑的培養(yǎng)基,更換無(wú)藥培養(yǎng)基對(duì)其培養(yǎng)2h。采用濃度梯度的3種抑制劑對(duì)A549/DDP進(jìn)行處理,采用CCK-8法對(duì)使用抑制劑后A549/DDP細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線并計(jì)算每種抑制劑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50。Epalrestat濃度梯度設(shè)置為0,20,30,40,50與60μmol/L;Salicylate濃度梯度設(shè)置為0,0.125,0.25,0.5,1，2mmol/L;Medroxyprogesterone acetate濃度梯度設(shè)置為0,5,10,20,40與60μmol/L。抑制劑濃度由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索得到。確定3種抑制劑的IC50濃度后,分別將這3種抑制劑與順鉑聯(lián)合作用于A549/DDP細(xì)胞,順鉑的濃度梯度分別為0,2,5,10,20,40和50μmol/L,采用CCK-8法測(cè)定這3種抑制劑對(duì)A549/DDP順鉑敏感性的影響。

1.7 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

RNA干擾實(shí)驗(yàn)基于Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑體系完成。本研究使用的small interference RNA(siRNA)序列見(jiàn)表2。轉(zhuǎn)染于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中完成,以scramble siRNA作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染完成后將培養(yǎng)基更換順鉑濃度分別為0,2,5,10,20,40和50 μmol/L的含藥培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置僅添加培養(yǎng)液的調(diào)零孔,培養(yǎng)48h后基于CCK-8法對(duì)細(xì)胞的活性進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算轉(zhuǎn)染后順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的IC50。

表2 siRNA序列Tab.2 Sequences of siRNA

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24h或48h后,分別將對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,基于Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒分析各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡情況,并統(tǒng)計(jì)分析各組間的差異。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means ± SD)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05表示差異有顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果最終篩選出1 214個(gè)差異表達(dá)的基因,其中656個(gè)基因在A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),余下558個(gè)基因則呈現(xiàn)為下調(diào)狀態(tài)。圖1為1 214個(gè)差異表達(dá)基因的火山分布圖[7]，綠色的點(diǎn)代表表達(dá)量下調(diào)的基因,紅色的點(diǎn)代表表達(dá)量上調(diào)的基因,黑色的點(diǎn)代表表達(dá)量沒(méi)有差異的基因。其中，AKR1家族的3個(gè)成員AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1同時(shí)在A549/DDP細(xì)胞中顯著上調(diào),其差異倍數(shù)分別為19.97，5.00和7.03。

每個(gè)點(diǎn)指代一個(gè)基因,紅色點(diǎn)表示該基因在A549/DDP細(xì)胞中顯著上調(diào),綠色點(diǎn)表示該基因在A549/DDP中顯著下調(diào),黑色點(diǎn)表示該基因在兩種細(xì)胞中無(wú)顯著表達(dá)差異。圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

2.2 qRT-PCR證實(shí)AKR1家族3個(gè)基因在A549/DDP細(xì)胞中顯著表達(dá)上調(diào)

基于qRT-PCR技術(shù),對(duì)3個(gè)基因在兩組細(xì)胞中的表達(dá)差異情況進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖2所示,轉(zhuǎn)錄組新一代測(cè)序平臺(tái)(Next Generation Sequencing,NGS)和qRT-PCR平臺(tái)的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.3 Salicylate和Epalrestat顯著提升A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

針對(duì)AKR1C1，AKR1B1及AKR1C3 3種酶,選取相應(yīng)的抑制劑Salicylate(SA),Epalrestat(EPA)與Medroxyprogesterone acetate(MA),將它們分別作用于A549/DDP細(xì)胞。48h后對(duì)3種抑制劑對(duì)細(xì)胞的毒性分別進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)SA和EPA均可顯著抑制A549/DDP細(xì)胞的活性,且有明顯的藥物的濃度依賴性。然而,不同濃度的MA均未對(duì)A549/DDP細(xì)胞的活性產(chǎn)生顯著影響(圖3)。

基于抑制率曲線,最終求得SA作用于A549/DDP細(xì)胞的IC50濃度約為0.60mmol/L,EPA為38.42μmol/L。我們進(jìn)一步使用3種抑制劑分別與順鉑聯(lián)合處理A549/DDP細(xì)胞,以探索AKR1的抑制對(duì)順鉑敏感性的影響。SA，EPA和MA的作用濃度分別為:0.60，38.42，30μmol/L。結(jié)果顯示，SA使得順鉑作用的IC50由34.4μmol/L±1.77μmol/L降低至15.26±2.36μmol/L(P<0.05),EPA則使其降低至21.56 ±1.29μmol/L(P<0.05),而MA并未顯著影響A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性(圖4A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SA或EPA與順鉑的聯(lián)合使用顯著改善了A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。我們進(jìn)一步檢測(cè)了SA或EPA增強(qiáng)順鉑敏感性的作用是否存在時(shí)間依賴性。結(jié)果表明，SA聯(lián)合順鉑處理24h即顯著增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞毒性(P<0.05),而EPA則在連續(xù)處理36h后才表現(xiàn)出明顯的順鉑增敏效應(yīng)(P<0.05)。這表明SA和EPA均顯著提升了A549/DDP的順鉑敏感性,且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性(圖4B)。

A為AKR1C1抑制劑Salicylate對(duì)A549/DDP作用結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.NS P<0.05;**vs.NS,P<0.01;***vs.NS P<0.001。B為AKR1C3抑制劑Epalrestat對(duì)A549/DDP作用結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.DMSO, P<0.05;***vs.DMSO，P<0.001。C為AKR1B1抑制劑Medroxyprogesterone acetate對(duì)A549/DDP作用結(jié)果。圖3 AKR1抑制劑對(duì)A549/DDP的作用Fig.3 Cyto-toxicity of AKR1 inhibitors on A549/DDP cells

A為SA,EPA以及MA分別與不同濃度順鉑聯(lián)合使用對(duì)A549/DDP作用結(jié)果。SA作用濃度為0.60mM,EPA作用濃度為38.42μM,MA作用濃度為30μM。B為SA及EPA分別與順鉑聯(lián)合使用對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制作用。分別于12h、24h、36h、48h以及72h對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*表示P<0.05。圖4 AKR1抑制劑對(duì)順鉑敏感性的影響Fig.4 Effect of AKR1 inhibitors on DDP sensitivity

2.4 AKR1C1和AKR1C3對(duì)細(xì)胞順鉑敏感性的影響

AKR1C1和AKR1B1的酶活抑制劑顯著提升了A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性,為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果,分別設(shè)計(jì)并合成了AKR1C1和AKR1B1的siRNA,在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了敲減。將特異性siRNA和scramble RNA分別轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞中,在siRNA轉(zhuǎn)染24h及48h后,分別對(duì)敲減效率進(jìn)行驗(yàn)證。siRNA轉(zhuǎn)染24h或48h后,AKR1C1及AKR1B1在A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著下調(diào);相較于短時(shí)間處理,48h的敲減效果更佳,其中AKR1C1的敲減效率可達(dá)90%以上,而AKR1B1的敲減效率則超過(guò)85%,因此我們選取48h作為基因敲減實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)(圖5)。由于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果未能證實(shí)AKR1C3與順鉑的耐藥相關(guān),故未進(jìn)一步研究AKR1C3干擾對(duì)A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響。轉(zhuǎn)染后,我們對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行順鉑處理并在48h后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。如圖5C所示,單獨(dú)敲減AKR1C1或AKR1B1均沒(méi)有顯著改善A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥情況;然而,在A549/DDP細(xì)胞中同時(shí)敲減AKR1C1和AKR1B1則顯著提升了細(xì)胞的順鉑敏感性(P<0.05)。

2.5 AKR1C1和AKR1C3對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響

基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們?cè)贏549/DDP細(xì)胞中同時(shí)敲減AKR1C1和AKR1B1并分別在順鉑處理24h和48h后,分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡情況。如圖6所示,相較于對(duì)照組細(xì)胞,同時(shí)敲減AKR1C1和AKR1B1顯著增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞的凋亡作用(P<0.05)。

A為 AKR1C1敲減效率驗(yàn)證結(jié)果;B為AKR1B1敲減效率驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示, n=3。**vs.scramble, P<0.01;***vs.scramble, P<0.001。C為基因敲減對(duì)A549/DDP順鉑敏感性的作用。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.與其相同順鉑處理濃度的scramble, P<0.05。圖5 AKR1基因敲減對(duì)A549/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響Fig.5 Effect of AKR1 genes knock-down on DDP sensitivity

3 討 論

醛酮還原酶超家族是以NADPH為輔酶的一類可將人體細(xì)胞內(nèi)具有強(qiáng)突變劑作用的醛或酮等分子還原為醇的蛋白質(zhì)總稱,而AKR1基因家族是其中一個(gè)分支[8]。研究表明,AKR1家族的多個(gè)成員與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):AKR1C1，AKR1C2和AKR1C3在肺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]和乳腺癌[11]組織中均呈現(xiàn)為異常高表達(dá);AKR1B1的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)并可作為患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物[12]。另有研究證實(shí),AKR1C1促進(jìn)NSCLC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13],且AKR1C3可作為區(qū)分NSCLC和SCLC的分子標(biāo)志物[14]。

AKR1家族成員AKR1C1,AKR1C3及AKR1B1還被證明與抗腫瘤藥物的耐藥性相關(guān):Shiiba團(tuán)隊(duì)的研究表明,AKR1C1和AKR1C3與順鉑和5-氟尿嘧啶這兩種化療藥物的耐藥性相關(guān)[15];Matsumoto R的實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)炎性細(xì)胞因子interleukin-1β下調(diào)AKR1C1基因的表達(dá),使得膀胱癌細(xì)胞的耐藥性大大降低[16];而Matsunaga T的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則證實(shí),基于siRNA技術(shù),下調(diào)AKR1C1表達(dá)同樣顯著提高了結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-15對(duì)順鉑的藥物敏感性[17];此外,Sonowal H團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)表明,抑制AKR1B1酶活性可增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性[18]。這些研究結(jié)果均提示了,AKR1家族的部分成員與多種腫瘤化療藥物的敏感性相關(guān),這與本課題組前期的研究結(jié)果相同。

在課題組前期的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中,AKR1家族的3個(gè)基因AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1在肺腺癌耐藥細(xì)胞株中表達(dá)量顯著上調(diào),這一結(jié)果揭示了這3個(gè)基因可能與肺腺癌A549細(xì)胞的順鉑耐藥有著緊密的關(guān)聯(lián)。但是，目前尚缺少系統(tǒng)性的研究證實(shí)該家族的基因在非小細(xì)胞肺癌順鉑獲得性耐藥中的作用。同時(shí),目前沒(méi)有任何專注于AKR1抑制劑在修復(fù)順鉑敏感性,即探索將AKR1抑制劑應(yīng)用于順鉑耐受的非小細(xì)胞肺癌患者臨床治療中的報(bào)道。所以，本研究就這3個(gè)基因是否能加強(qiáng)肺腺癌耐藥細(xì)胞的順鉑敏感性做了進(jìn)一步的研究和探索。

我們基于抑制劑阻斷和RNAi技術(shù),對(duì)AKR1家族基因AKR1C1，AKR1B1和AKR1C3進(jìn)行了功能性驗(yàn)證。抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AKR1C1或AKR1B1酶活抑制劑與順鉑聯(lián)合使用可顯著提高A549/DDP細(xì)胞的順鉑敏感性;而抑制AKR1C3酶活性并不能引起肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)。究其原因可能有以下兩點(diǎn):第一,AKR1C3的表達(dá)上調(diào)與順鉑耐藥無(wú)關(guān),而是“被動(dòng)”受其他信號(hào)因子調(diào)控的結(jié)果,這與腫瘤發(fā)生中產(chǎn)生的‘passive mutation’情況相似,即AKR1C3并非調(diào)控順鉑敏感性的關(guān)鍵因子;第二,AKR1家族成員之間或與其他家族的藥物代謝酶間存在功能上的重疊現(xiàn)象,可在一定程度上彌補(bǔ)抑制劑造成的功能阻斷。敲減實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在A549/DDP細(xì)胞中同時(shí)敲減AKR1C1和AKR1B1不僅增強(qiáng)了順鉑的細(xì)胞毒性,且同時(shí)顯著增強(qiáng)了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)，敲減AKR1C1和AKR1B1可顯著提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,但單獨(dú)敲減二者之一則沒(méi)有明顯的作用,即從側(cè)面證實(shí)了AKR1家族成員之間存在的功能重疊現(xiàn)象。同時(shí)也表明,AKR1C1與AKR1B1都在調(diào)節(jié)A549細(xì)胞順鉑耐藥中起到關(guān)鍵作用。

綜上所述,本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步地證實(shí)了AKR1C1與AKR1B1基因在調(diào)節(jié)A549細(xì)胞順鉑耐藥中起到了關(guān)鍵作用。本階段的研究成果為解決肺腺癌臨床治療中出現(xiàn)的順鉑耐藥問(wèn)題提供了解決思路,并為肺腺癌的臨床精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的潛在分子靶標(biāo),同時(shí)本研究成果也為其他惡性腫瘤的治療提供了理論支持。