鐘永莉 陳玟旭 譚宏超

(云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 昆明 650500)

甜龍竹(Dendrocalamusspp.)俗稱甜竹，包括云南甜龍竹(DendrocalamusbrandissKurz)、版納甜龍竹(DendrocalamushamiltoniiNees et Arn.ex Munro)和馬來甜龍竹 [Dendrocalamusasper(J.A.et J.H.Schult.)Backer ex Heyhe]3 個種，屬竹亞科牡竹屬大型叢生竹類[1]。其中，云南甜龍竹直徑10～16 cm，竹高 15～25 m，自然筍期 6—11月(在熱量足、冬春季節(jié)進(jìn)行澆水覆蓋條件下，全年都可出竹筍)，是極好的筍用竹。其筍味脆甜可口，可作為刺生、水果、沙拉食材鮮食，也可炒、燉、煮、煎等多種烹飪方法食用。竹筍生長過程中幾乎沒有病蟲害，無需使用農(nóng)藥；開始產(chǎn)筍后若只施有機肥，筍味更美，是天然綠色健康食材[2]。

組織培養(yǎng)技術(shù)是快速獲得良種種苗的重要途徑。1968年Alexander 等[3]首次報道了利用竹子的成熟種胚離體培養(yǎng)而獲得完整植株。利用版納甜龍竹的腋芽作為外植體，通過不同濃度的激素誘導(dǎo)也獲得了再生植株[4－5]。目前，竹子組織培養(yǎng)技術(shù)已成為竹苗繁育、竹子生物技術(shù)、種質(zhì)遺傳改良等研究得以實現(xiàn)的重要技術(shù)基礎(chǔ)，受到越來越多的關(guān)注[6]。本文通過云南甜龍竹組培及移栽試驗，試圖找到適合其組培繁殖的各項條件，以降低育種成本，對于增加云南甜龍竹資源，提升其利用價值具有重要的現(xiàn)實意義。

1 試驗地概況

組織培養(yǎng)試驗在云南師范大學(xué)呈貢校區(qū)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行，這里擁有豐富的云南甜龍竹資源及先進(jìn)的研究設(shè)施，可滿足組織培養(yǎng)所需要的條件。甜龍竹組培苗的移栽試驗選擇在云南省昆明市嵩明縣云南珍竹農(nóng)業(yè)科技有限公司林地，該公司擁有溫室大棚等先進(jìn)設(shè)施，技術(shù)人員充裕，適合開展各類林業(yè)研究。

2 材料與方法

2.1 組織培養(yǎng)試驗

2.1.1 外植體選取

外植體宜選取芽分化程度較低的部位為好，且性狀優(yōu)良。試驗設(shè)置6 種類型的外植體：種子、1年生種子苗莖段、2年生種子苗莖段、3年生種子苗莖段、扦插苗節(jié)芽、成年竹叢枝芽。每種外植體各取30 個樣本進(jìn)行試驗。將外植體經(jīng)無菌處理移入盛有MS＋6－BA 2.0 mg/L 的培養(yǎng)基瓶內(nèi)，連續(xù)觀察30 d。記錄每種外植體開始生芽、褐化、發(fā)霉的時間，并計算外植體的芽誘導(dǎo)率。

2.1.2 外植體消毒

外植體消毒前先用水沖洗除去外部污染物，然后剝除外層表皮或組織。對外植體進(jìn)行消毒，在實驗室的無菌操作臺上進(jìn)行。將外植體用自來水沖洗6～8 h 后，用 70%的酒精浸泡 30 s，再用一定濃度的升汞消毒一定時間，最后用無菌水沖洗5 次。將種子放到置有兩層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于顯微鏡下切取種胚并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；其他類型外植體直接植入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中[8]。

選擇培養(yǎng)基MS＋6－BA2.0 mg/L，試驗設(shè)置了4種質(zhì)量百分比濃度的升汞進(jìn)行消毒：0.05%、0.10%、0.15%、0.20%；并依據(jù)經(jīng)驗用 0.1%升汞設(shè)置 4 種消毒時間：3、6、9、12 min。接種 30 d 后分別記錄外植體的芽誘導(dǎo)率。

2.1.3 適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選取

試驗設(shè)置4 種外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS、1/2MS、3/4MS、1.5MS，試驗培養(yǎng)基對6 種外植體的組培效果，記錄每種外植體的發(fā)芽率。誘導(dǎo)培養(yǎng)基均添加20 g/L 白糖、5 g/L 瓊脂，pH 值為 5.8。培養(yǎng)溫度25～28 ℃，誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)時光照度 500 Lx，生根培養(yǎng)時前期光照度為500 Lx，20 d 后光照度為1 500 Lx，光照時間為 12 h/d[9]。

2.1.4 培養(yǎng)基中6－BA 濃度的選取

外植體經(jīng)充分消毒后分別接種在添加不同濃度的6－BA 的MS 培養(yǎng)基中，30 d 后記錄外植體的芽誘導(dǎo)率。6－BA 設(shè)置 5 種濃度水平：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。

2.1.5 叢芽誘導(dǎo)、叢芽繼代、生根培養(yǎng)

利用6－BA、KT、激素混合配比的培養(yǎng)基 MA＋6－BA 2.0 mg/L＋KT 0.5 mg/L 對其進(jìn)行叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。待幼芽發(fā)育到一定階段，將竹苗從培養(yǎng)基中取出，移至新的培養(yǎng)基中，新培養(yǎng)基的激素配比為MS＋6－BA 1.5 mg/L，用于促進(jìn)芽的生長。當(dāng)芽增殖到一定數(shù)量后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中(1/2MS＋NAA1.0 mg/L)，進(jìn)行生根培養(yǎng)。

2.2 組培苗移栽

用以1年生種子苗莖段為外植體培育的1年生組培苗進(jìn)行移栽試驗。試驗設(shè)置6 種育苗基質(zhì)(珍珠巖、紅土、黑土、植物碎末、泥炭、蛭石)和 4種育苗環(huán)境(小弓棚、大棚、大棚套小棚、遮陽網(wǎng))。3 個月后觀察幼苗生長情況，調(diào)查指標(biāo)有移栽成活率、每叢株數(shù)、苗木平均地徑和平均高。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同外植體的組培效果

不同外植體組培效果的調(diào)查結(jié)果見表1。從表1中可以看出：1年生種子苗莖段接種后最先生芽，為接種后第3 d，而出現(xiàn)褐化和發(fā)霉的時間最晚，分別為接種后第18 d 和第19 d，芽誘導(dǎo)率最高，為97.2%；其次是2年生種子苗莖段和3年生種子苗莖段，出現(xiàn)生芽的時間分別為接種后第4 d 和第6 d，出現(xiàn)褐化的時間分別為第15 d 和第10 d，出現(xiàn)發(fā)霉時間分別為第16 d 和第14 d 天，芽誘導(dǎo)率分別為95.1%和91.7%；扦插苗節(jié)芽和成年竹從枝芽的生芽時間要晚于種子外植體，且發(fā)霉時間要早于種子，但芽誘導(dǎo)率比種子外植體高?？梢?，云南甜龍竹組培宜選擇1年生種子苗莖段作為外植體。

表1 云南甜龍竹不同外植體接種后的變化

3.2 消毒劑濃度和消毒時間對外植體組培效果的影響

表2 為4 種質(zhì)量百分比濃度的升汞對外植體進(jìn)行消毒，其組培效果的統(tǒng)計結(jié)果?？梢钥闯觯黝愋屯庵搀w均在升汞質(zhì)量百分比濃度為0.10% ～0.15%時芽誘導(dǎo)率較高；而用較低或較高濃度的升汞消毒，其外植體的芽誘導(dǎo)率均較低。

用0.1%升汞對外植體消毒不同時間，外植體的生芽情況見表3?？梢钥闯?，消毒時間在6 和9 min時外植體的芽誘導(dǎo)率較高，消毒時間不足3 min 或是超過9 min 后外植體芽誘導(dǎo)率均降低；同時，隨外植體木質(zhì)化程度增加，所要求的消毒時間也延長。

表2 不同濃度的升汞處理外植體的芽誘導(dǎo)率 %

表3 升汞不同處理時間外植體的芽誘導(dǎo)率 %

3.3 不同培養(yǎng)基對外植體組培效果的影響

表4 為外植體接種在4 種不同培養(yǎng)基中的生芽情況?？梢园l(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基中的外植體芽誘導(dǎo)率最高，說明MS 培養(yǎng)基最適合云南甜龍竹的組織培養(yǎng)。

表4 在不同培養(yǎng)基中外植體的芽誘導(dǎo)率 %

3.4 培養(yǎng)基中6－BA濃度對外植體組培效果的影響

在MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度的6－BA，外植體接種后的生芽情況見表5。可以看出，在添加1.5 ～2.0 mg/L 6－BA 的 MS 培養(yǎng)基中，6 種外植體的芽誘導(dǎo)率均較高。6－BA 為細(xì)胞分裂素，適當(dāng)濃度的6－BA 有利于外植體細(xì)胞組織的分裂分化。

3.5 育苗基質(zhì)對組培苗生長的影響

將用1年生種子苗莖段經(jīng)培育生根后的組培苗移栽至6 種基質(zhì)中，3 個月后幼苗的生長情況見表6?？梢钥闯觯煌|(zhì)對組培苗的生長有較大的影響，其中以植物碎末為基質(zhì)的幼苗成活率最高，每叢株數(shù)最多，幼苗地徑和苗高度最大；其次為蛭石基質(zhì)，幼苗生長也較好。

表5 培養(yǎng)基中6－BA 不同濃度處理的外植體芽誘導(dǎo)率 %

表6 不同育苗基質(zhì)中組培苗的生長情況

3.6 不同環(huán)境對組培苗生長的影響

以植物碎末為育苗基質(zhì)，將生根后的組培苗在4 種小環(huán)境下培育，3 個月后幼苗的生長情況見表7。可以看出，在大棚套小棚的環(huán)境下，幼苗生長表現(xiàn)最好，移栽成活率可達(dá)91.6%，平均每叢株數(shù)為 12 株，地徑達(dá) 1.2 cm，苗高達(dá) 1.9 cm。對幼苗生長有利的其他環(huán)境條件依次為大棚、小弓棚、遮陽網(wǎng)。

表7 不同環(huán)境中組培苗的生長情況

4 結(jié)論

試驗結(jié)果顯示，云南甜龍竹組培繁育以1年生種子苗莖段作為外植體，用0.10%～0.15%的升汞消毒6～9 min，使用標(biāo)準(zhǔn) MS 培養(yǎng)基，添加濃度為1.5～2.0 g/mL 的6－BA，能夠獲得較高的芽誘導(dǎo)率。在1年生組培苗移栽時，采用大棚套小棚的移栽環(huán)境，以植物碎沫作為栽培基質(zhì)，苗木成活率較高，幼苗生長較好。