王 昱

(隴南師范高等專科學校 農(nóng)林技術(shù)學院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 成縣 742500)

中國自然資源復(fù)雜，飲水型砷中毒分布范圍廣泛，影響人群眾多，是環(huán)境砷中毒的主要類型.目前，我國砷暴露人群已經(jīng)超過1 500萬[1].砷通過食物鏈或飲用水進入人體，容易蓄積，潛伏期長，危害大.國際癌癥研究中心明確將砷及其化合物劃分為人類確定的致癌物.大量研究顯示，慢性飲水型高砷暴露影響動物的空間學習、記憶能力下降[2]，損傷神經(jīng)元或增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷易感性[3]，誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細胞凋亡，并引起免疫功能損傷[4].近幾年，國內(nèi)外學者廣泛關(guān)注乙酰膽堿、單胺類(去甲腎上腺激素、五羥色胺)和氨基酸類(γ-氨基酸)在神經(jīng)毒物致學習記憶損傷中的作用及其機制[5-7].慢性砷暴露可影響大鼠腦中多巴胺、去甲腎上腺素等多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成和分泌，從而擾亂神經(jīng)系統(tǒng)的功能[8].對于慢性砷中毒，臨床上常采用金屬螯合劑(二巰丁二酸及其衍生物二巰丁二酸鈉等)注射治療，但這些藥物的副作用也相對比較大.橄欖苦苷屬于天然的多酚化合物，是油橄欖中含量最多的最主要的活性成分[9].本課題組前期已經(jīng)研究了橄欖苦苷在降血糖、抗衰老及降血脂等方面的藥理作用[10-12].為了進一步研究橄欖苦苷的藥理作用，本研究在 As2O3染毒小鼠的基礎(chǔ)上給予橄欖苦苷干預(yù)，觀察大腦組織部分神經(jīng)遞質(zhì)基因表達的變化，探討其拮抗神經(jīng)毒性的保護作用.

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與給藥

健康昆明小鼠30只(購于蘭州大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證編號14-006，體質(zhì)量 18～20 g，雌雄各半)，同條件飼養(yǎng)一周后隨機分為3組，每組10只：正常對照組、模型組和橄欖苦苷組.模型組每天灌胃4 mg /kg·bw劑量的As2O3溶液，橄欖苦苷組灌胃4 mg /kg·bw劑量的As2O3溶液[13]，同時灌胃100 mg/kg·bw的橄欖苦苷[9](隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供)，正常對照組每天灌胃等量的0.9% 生理鹽水，連續(xù)處理5周后，斷頭處死小鼠，立即取大腦儲存于RNA保存液中，備用.

1.2 總RNA 的提取和基因芯片雜交

分別研磨各實驗組小鼠大腦，按照TRIzol 試劑盒(美國Invitrogen 公司)操作說明從中抽提總RNA，用RNeasy Mini Kit(美國Oiagen公司)進行純化.用UV-1800紫外分光光度儀(日本Tokyo)測定RNA的濃度和純度，變性膠電泳(美國Sigma公司DEPC水和溴酚藍，Bocherigmer公司MOPs緩沖液)檢測RNA有無降解，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA 探針，同時用生物素標記探針，片段化處理探針，45 ℃下在雜交箱640 (美國Affymetrix 公司)中與Mouse Genome 4302.0 Araay 基因芯片雜交16 h，全自動芯片洗滌工作站450(美國Affymetrix 公司)中洗脫、染色；最后用GeneArrayTM掃描儀3000(美國Affymetrix 公司)掃描雜交信號.

1.3 芯片數(shù)據(jù)處理和生物學信息分析

實驗數(shù)據(jù)用Microarray Suite Version 5.0軟件(美國Affymetrix 公司)進行分析，在對單個樣本表達分析的前提下，建立正常對照組、模型組和橄欖苦苷組基因表達譜，其中p>0.06 為不表達，p<0.04為表達，0.04～0.06 為臨界.然后將各實驗組的基因表達譜進行組間比較，再根據(jù)信號強度比值的對數(shù)(signal log ratio，SLR)判斷.如果SLR>1(即表達倍數(shù)>2)為表達上調(diào)，SLR < -1(即表達倍數(shù)<2)為表達下調(diào)，建立各組差異表達的數(shù)據(jù)庫.

2 結(jié)果

2.1 各實驗組大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)基因表達的變化

與正常對照組比較，模型組小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha和Pck1的表達均下調(diào).與模型組比較，橄欖苦苷組小鼠大腦組織基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha和Pck1的表達均上調(diào).與正常對照組比較，除了基因Pck1、Chat外，其他基因在橄欖苦苷組小鼠大腦組織的表達變化不顯著，差異無統(tǒng)計學意義(表1).

表1橄欖苦苷對小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶相關(guān)基因表達的影響

2.2 橄欖苦苷對神經(jīng)遞質(zhì)受體基因的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達均下調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達上調(diào).與模型組比較，橄欖苦苷組小鼠大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達均上調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達下調(diào).除了基因Adra2a、Adra2b 和Adrb3外，其他基因在正常對照組與橄欖苦苷組小鼠大腦組織的表達差異無統(tǒng)計學意義(表2).

表2橄欖苦苷對小鼠大腦組織神經(jīng)遞質(zhì)受體相關(guān)基因表達的影響

3 討論

砷可通過血腦屏障進入腦組織，神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因表達發(fā)生變化[2]，導(dǎo)致腦功能失調(diào)，學習記憶能力減退[14].本實驗利用基因芯片技術(shù)分析結(jié)果顯示，模型組小鼠大腦中乙酰膽堿、單胺類(去甲腎上腺激素、五羥色胺)和氨基酸類(γ-氨基酸)神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因(Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1)的表達均低于正常對照組，這與[2]的研究結(jié)果一致.經(jīng)橄欖苦苷干預(yù)后，小鼠大腦中神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1的表達顯著升高，提示橄欖苦苷可能通過升高大腦中神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶基因Chat、Th、Dbh、Aldh7a1、Tph1、Sdha、Pck1的表達而提高大腦中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度.

受體相互作用是共同表達在突觸區(qū)的受體之間的緊密聯(lián)系，在受體功能的調(diào)節(jié)、突觸的傳導(dǎo)、神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮著重要的作用.多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)屬于兒茶酚胺類，在大腦中含量最豐富，能調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能.多巴胺受體(dopamine receptor，DR)可以激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，DR為7個跨膜區(qū)域組成的G蛋白耦聯(lián)受體蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)有五種DR亞型(D1～D5)[6].王艷艷等[2]研究表明，多巴胺受體存在于大腦皮層和海馬，砷導(dǎo)致多巴胺受體基因(Drd3、Drd4)表達下調(diào)，進而影響了γ-氨基丁酸的傳遞.五羥色胺受體調(diào)節(jié)許多神經(jīng)遞質(zhì)(包括谷氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺、腎上腺素/去甲腎上腺素和乙酰膽堿等)，影響焦慮、認知、學習、記憶、情緒和體溫調(diào)節(jié)等生物學和神經(jīng)學過程.大量腦與行為的研究提示，五羥色胺能系統(tǒng)與多巴胺能系統(tǒng)在多個層面上存在交互作用，從細胞放電、神經(jīng)遞質(zhì)釋放到行為都有體現(xiàn)[7].本實驗研究結(jié)果顯示，砷中毒小鼠經(jīng)橄欖苦苷干預(yù)后，大腦組織基因Chrm1、Drd3、Drd4、Htr1d、Htr5b、Adra1a、Adra2a、Adra2b、Adrb3、Grin2d和Gria2的表達均上調(diào)，基因Drd1a、Htr1f、Htr4、Htr7和Grin3b的表達下調(diào)，這表明橄欖苦苷影響了小鼠大腦組織內(nèi)部分神經(jīng)遞質(zhì)基因的表達，從而影響其受體基因之間的交互作用及表達水平，這可能是其提高小鼠學習記憶能力的分子機制之一.但還需進一步驗證這些受體基因之間的交互作用及異常表達，基因在蛋白水平的表達，以及與改善砷暴露人群神經(jīng)行為之間的關(guān)系.