劉 俊，楊 勝，羅明江，陶 娜，趙 訓，張元梅

體內抗氧化酶是機體抗氧化損傷的重要屏障，抗氧化酶基因的多態(tài)性可能與該酶的活性及轉錄活性有關，從而影響個體間對疾病的易感性不同[1]。大量研究表明，抗氧化酶基因的多態(tài)性與氧化應激相關疾病，如心血管疾病、癌癥、糖尿病和阿爾茨海默病密切相關[2-3]。研究表明，氧化應激在燃煤型氟中毒所致氟斑牙的發(fā)生過程中可能起重要作用[4]，而個體對氟的敏感性或耐受性存在差異，提示氟中毒可能存在遺傳易感性[5-6]，但有關抗氧化基因多態(tài)性與氟中毒的研究較少。過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種內源性抗氧化酶，將過氧化氫分解成水和氧氣，在控制細胞中的過氧化氫濃度中起主要作用，可以保護細胞免受氧化應激[7]。過氧化氫酶與其他抗氧化酶一起使用，在抗氧化應激的主要防御中發(fā)揮著不可或缺的作用。研究報道，編碼過氧化氫酶基因的功能多態(tài)性將影響酶的活性，導致羥基自由基形成增加和疾病風險增加[8]。因此，本研究旨在通過病例對照研究方法探討CAT基因單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙之間的關系，為氟中毒的精確預防提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1對象 在貴州省氟中毒重病區(qū)織金縣收集氟斑牙患者195例，男性93例，女性102例，年齡(49.8±12.7)歲(21～78歲)，尿氟(1.87±1.24)mg/L,鈣攝入量(507.18±280.90)mg/d。氟斑牙的診斷根據(jù)《氟斑牙診斷標準》(WS/T208-2011)，并結合流行病學和臨床表現(xiàn)癥狀，由氟斑牙專家做出診斷。排除各種齲齒及四環(huán)素牙等其他牙齒疾病，排除中風、腫瘤、肝硬化等重要疾病及認知或精神異常者。同時收集健康對照組195例，男性80例，女性115例，年齡(46.7±14.4)歲(21～76歲)，尿氟(1.38±1.24)mg/L,鈣攝入量(556.96±313.43)mg/d。納入標準：在招募地居住≥10年，年齡>20歲；排除標準同病例組。本研究經單位倫理委員會批準同意實施。

1.2方法

1.2.1現(xiàn)場調查 由經過專門培訓的調查員面對面詢問完成，調查內容由4部分組成，即一般人口學資料、生活方式、氟中毒相關情況以及膳食調查。

1.2.2基因組分型 采用EDTA抗凝管收集研究對象的外周靜脈血5 mL，-70 ℃保存?zhèn)溆谩２捎萌蚪MDNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。基因分型采用高通量TaqMan-MGB實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術進行檢測，儀器為實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler480 Software，瑞士羅氏公司)。所有試驗由上海生物工程股份有限公司完成。

2 結 果

2.1一般情況 經檢驗，健康對照組中CAT rs769217和rs2300182兩個位點的基因型頻率分布符合Hardy-Weinbery平衡定律(P>0.05)。病例組的rs769217和rs2300182位點基因型CC、CT和TT分布頻率與對照組比較，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，2組間在年齡、民族、文化程度、尿氟水平、烘烤糧食、爐灶改良、使用燃料的類型等方面存在明顯差異(P<0.05，表1)。

表1 研究對象的一般情況Tab 1 The characteristics of participants

表中對照組及病例組數(shù)據(jù)為n(%).

2.2CAT基因不同遺傳模式與氟斑牙的關系 將rs769217和rs2300182位點基因型分成共顯性、超顯性、顯性、隱性和累加模式5種不同的遺傳模式，單因素分析未發(fā)現(xiàn)CAT rs769217及rs2300182位點不同遺傳模式與氟斑牙有關，校正性別、年齡、婚姻狀況、民族、文化程度、飲酒、吸煙、飲茶、使用燃料種類、改良爐灶、烘烤糧食及鈣攝入水平后，仍未發(fā)現(xiàn)2個位點與氟斑牙存在關聯(lián)(表2)。

表2 CAT單核苷酸多態(tài)性在病例組與對照組的分布情況及風險估計Tab 2 The distribution of genotype frequency and odds ratio of dental fluorosis CAT SNP

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.

2.3CAT單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境交互作用 將研究對象按性別、吸煙、民族和鈣攝入水平進行分層并做交互作用分析，多因素Logistic回歸發(fā)現(xiàn)，在鈣攝入較多時(>482 mg/d)，rs769217位點AT+TT基因攜帶者相對于AA基因型攜帶者氟斑牙明顯降低，而鈣攝入較少時(<482 mg/d)，該保護作用消失。交互作用分析發(fā)現(xiàn)，rs769217位點基因多態(tài)性與膳食鈣的攝入水平存在交互作用(P交互作用<0.05)，OR以及95%CI為0.79(0.63，0.95)，具體見表3～4。

表3 rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析Tab 3 The interaction between rs2300182 SNP and environment factors

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.

3 討 論

CAT是一種抗氧化酶，其活性對于防止由活性氧引起的損傷至關重要。人類的CAT基因位于染色體11 p13，全長約37 kb，由12個內含子和13個外顯子組成。CAT基因多態(tài)性可能與CAT的活性有關，從而影響不同個體對疾病的易感性[8]。Suzen等研究表明，CAT基因多態(tài)性引起不同個體的CAT表達差異，導致機體對活性氧的敏感性不同，這可能引起體內羥基自由基增多從而增加疾病風險[9]。氧化應激是燃煤型地方病氟中毒的重要機制，目前關于CAT基因多態(tài)性氟中毒的關聯(lián)研究較少。涂茜等應用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態(tài)性分析方法，研究CAT基因啟動子區(qū)-262C/T、-21A/T多態(tài)性與燃煤型氟中毒之間的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)改灶干預組、非干預組和對照組中CAT基因型頻率及等位基因頻率分布無明顯差異[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，rs2300182和rs769217兩個位點的單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙風險無明顯關聯(lián)。原因可能是，氟斑牙是一種較復雜的地球化學性疾病，可能是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結果，CAT基因與環(huán)境因素存在交互作用，導致其效應被掩蓋。

本研究探討年齡、性別、民族、吸煙及鈣攝入量等因素與CAT基因兩個位點的交互作用，發(fā)現(xiàn)膳食鈣的攝入水平與CAT rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性存在交互作用，提示膳食鈣在CAT rs2300182位點不同基因型中對氟斑牙的作用有所區(qū)別。研究已證明，基因與飲食相互作用可能影響疾病風險[11-13]。Takeshige等研究發(fā)現(xiàn)，維生素D受體基因多態(tài)性可能與日本患結直腸癌的風險降低是否有關取決于膳食鈣的攝入量[11]。Larsen等分析了54個單核苷酸多態(tài)性與肥胖相關指標的關系，發(fā)現(xiàn)增加鈣可降低易肥胖人群的腰圍水平[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣攝入水平較高的AT+TT基因攜帶者發(fā)生氟斑牙的風險明顯低于AA型攜帶者。該結果表明，通過補鈣預防氟斑牙可能只對AT+TT基因型攜帶者有用。徐輝等發(fā)現(xiàn)，低鈣時自由基含量及腎組織細胞內活性氧明顯升高，CAT的活性在低鈣也明顯降低，因此膳食鈣及CAT的交互作用可影響氧化應激水平，從而修飾CAT與氟斑牙風險的關聯(lián)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CAT基因與氟中毒無關聯(lián)可能被膳食營養(yǎng)等環(huán)境因素掩蓋。然而，其潛在的生物學機制仍有待闡明。

綜上所述，CAT rs769217位點單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙的風險之間無明顯關聯(lián)，而CAT rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙風險降低有關，但取決于鈣的攝入量。本研究招募的對象來自鄉(xiāng)村居民，均為當?shù)鼐幼?0年以上的成年人，但因為年輕男性多外出務工，本研究納入的多為中老年女性。因此本研究存在一定的選擇偏倚。但本研究分層分析未發(fā)現(xiàn)CAT rs769217及rs2300182位點與氟斑牙的關系受性別和年齡的影響。本研究結果提示，補鈣預防氟斑牙可能只對AT+TT基因型攜帶者有用，因此通過補鈣預防氟中毒需要個體化，為探索地方性氟中毒精準預防及干預提供了理論依據(jù)和參考。

表4 rs769217位點單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境的交互作用分析Tab 4 The interaction between rs769217 SNP and environment facors

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.