楊先碧

自古以來(lái)，人類(lèi)的好奇心不斷地推動(dòng)著社會(huì)進(jìn)步。在好奇心的驅(qū)使下，人類(lèi)不僅把目光投向數(shù)萬(wàn)光年之外的星空，也把視野推進(jìn)到微納尺寸的微觀(guān)世界。對(duì)生命的細(xì)節(jié)看得越仔細(xì)，就越有利于人們知曉生命的本質(zhì)。正是在這樣的背景下，顯微技術(shù)成為熱門(mén)的科研領(lǐng)域，相關(guān)科學(xué)家也多次榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。瑞士科學(xué)家雅克·杜波謝、美國(guó)科學(xué)家阿希姆·弗蘭克、英國(guó)科學(xué)家理查德·亨德森，也因在冷凍顯微電鏡領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)，而分享了2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

顯微鏡放大微小樣品

如何看清微觀(guān)世界里的小東西？我們首先想到的就是使用顯微鏡。原始的光學(xué)顯微鏡是一個(gè)高倍率的放大鏡。據(jù)記載，在1610年前，意大利物理學(xué)家伽利略己制作過(guò)復(fù)式顯微鏡，并觀(guān)察了昆蟲(chóng)的復(fù)眼。這是一種己具目鏡、物鏡和鏡簡(jiǎn)等裝置，并被固定在支架上的顯微鏡。

1665年前后，英國(guó)生物學(xué)家胡克發(fā)明了比較類(lèi)似我們現(xiàn)在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室里用的顯微鏡，并通過(guò)這臺(tái)顯微鏡看到了軟木中網(wǎng)格狀的結(jié)構(gòu)，胡克稱(chēng)之為“細(xì)胞”。這是人類(lèi)歷史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，大大推動(dòng)了生物學(xué)的發(fā)展。

與胡克同時(shí)代的荷蘭科學(xué)家列文虎克對(duì)顯微技術(shù)的推動(dòng)做出了主要貢獻(xiàn)。他一生制作了不少于247架顯微鏡，觀(guān)察了許多細(xì)菌、原生動(dòng)物和動(dòng)植物組織，是第一個(gè)用顯微鏡做科學(xué)觀(guān)察的人。到18世紀(jì)，顯微鏡已有許多改進(jìn)，應(yīng)用比較普遍，已作為一種商品進(jìn)行生產(chǎn)。

然而，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡不能無(wú)限制地放大微小的樣品，它會(huì)受到“阿貝原則”的限制。什么是“阿貝原則”？1873年，德國(guó)顯微鏡學(xué)家恩斯特·阿貝通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，由于光波相互干擾的原因，光學(xué)顯微鏡不能無(wú)限度地放大微小樣品，最多只能“看到”光波波長(zhǎng)一半的樣品，即尺寸不小于200納米的樣品。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱(chēng)為光學(xué)顯微鏡的“繞射極限”。

如何看清生物大分子

光學(xué)顯微鏡只能看到細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)較大的細(xì)胞器，要看到100納米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物體細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子。每個(gè)生物大分子內(nèi)有幾千到幾十萬(wàn)個(gè)原子，分子量從幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)以上。生物大分子的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，但其基本的結(jié)構(gòu)單元并不復(fù)雜。蛋白質(zhì)分子是由氨基酸分子以一定的順序排列成的長(zhǎng)鏈。氨基酸分子是大部分生命物質(zhì)的組成材料，不同的氨基酸分子有好幾十種。生物體內(nèi)的絕大多數(shù)酶就屬于蛋白質(zhì)，是生物體維持正常代謝功能所不可缺少的。

為了突破光學(xué)顯微鏡的局限，弄清楚生物大分子的構(gòu)造，科學(xué)家想了很多辦法。有的科學(xué)家制造出超高分辨率光學(xué)顯微鏡，其實(shí)是讓生物分子發(fā)熒光，這種方法的使用有一些局限性。因?yàn)樗怯眉す鈦?lái)激發(fā)生物大分子，這樣照射時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則可能殺死生物大分子。但是，照射時(shí)間短又可能會(huì)失去一些重要信息。而且，超高分辨率光學(xué)顯微鏡最高只能達(dá)到10納米的分辨率，仍然無(wú)法看清分子內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

還有一種很常用的方法是“x射線(xiàn)晶體衍射”技術(shù)。之前，亨德森就非常喜歡用這種技術(shù)來(lái)研究生物大分子。但是，這種技術(shù)也有很明顯的局限性，那就是這種方法需要首先獲取純度很高的生物大分子晶體。而不少生物大分子結(jié)晶情況不理想，甚至有的就不能結(jié)晶。膜蛋白就是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。對(duì)于大多數(shù)的生物，膜蛋白占了蛋白質(zhì)組的20%～30%，藥物靶點(diǎn)的達(dá)到40%以上。然而，這些分子的結(jié)構(gòu)很少能通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)來(lái)闡明。

科學(xué)家還想到的方法是用電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡）。電鏡的分辨率的確很高，可以達(dá)到納米級(jí)以下，看清生物大分子是沒(méi)啥問(wèn)題了。電子的波長(zhǎng)是光子波長(zhǎng)的十萬(wàn)分之一左右，就像一根極細(xì)的探針，理論上它打在蛋白質(zhì)分子等生物大分子身上能被反射，這些反射的電子就能產(chǎn)生一張照片，這就是電鏡的基本原理。這也是電鏡能比光學(xué)顯微鏡分辨率高得多的原因。

起初，電鏡是在材料科學(xué)領(lǐng)域中使用的，主要是用其高分辨率來(lái)解析材料的結(jié)構(gòu)。電鏡在材料科學(xué)上的應(yīng)用遙遙領(lǐng)先于在生命科學(xué)上的應(yīng)用。直到1947～1961年，生物學(xué)家才借鑒材料科學(xué)中的重金屬染色技術(shù)，利用電鏡技術(shù)觀(guān)測(cè)到了許多細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，如葉綠體、線(xiàn)粒體、核糖體，等等。然而，電鏡的局限性也很明顯，那就是不能看到活生生的生物大分子。因?yàn)殡婄R需要在高真空條件下工作，而生物樣品的含水量很高，水分的揮發(fā)使整個(gè)樣品無(wú)法保持真空。另外，電鏡的電子攜帶的能量很高，會(huì)把細(xì)胞“殘忍地?zé)馈?。這樣一來(lái)，生物學(xué)家就難以研究分子在活細(xì)胞中的正?；顒?dòng)。

速凍凝固生命細(xì)節(jié)

為了讓電鏡也能看到活細(xì)胞內(nèi)的生物分子，科學(xué)家想了很多辦法。最終想到的辦法就是速凍。這就好比科幻小說(shuō)中的冷凍休眠，把活人速凍之后，人體組織和細(xì)胞進(jìn)入幾乎沒(méi)有活動(dòng)的休眠狀態(tài)。多年以后，采用合理的方法解凍，人體又活過(guò)來(lái)了。也就是說(shuō)，速凍的細(xì)胞雖然幾乎不能活動(dòng)，但是它們的的確確具有生物活性。

在冷凍電鏡中，生物大分子被迅速冷凍，使得標(biāo)本內(nèi)部和周?chē)乃还潭椴ＡB(tài)，以防止晶體的形成。玻璃態(tài)——一種看上去是固體，但其分子排列是無(wú)序的形態(tài)，所以是不折不扣的流體。為什么是玻璃態(tài)而不是冰（晶體）呢？首先，是為了保護(hù)生物大分子，凍成冰有可能讓生物大分子發(fā)生脫水，冰晶也容易傷害生物。其次，冰會(huì)衍射電子，從而降低電鏡觀(guān)察的圖像質(zhì)量。