張杰鈺，劉思農(nóng)，洪思丹，伏 歡，冉莉萍

(揚(yáng)州大學(xué)廣陵學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

1 引言

小麥(TriticumaestivumL.)是一種重要的糧食作物，在世界各地廣泛種植。我國(guó)是小麥的種植大國(guó)，小麥的種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于水稻(OryzasativaL.)。小麥籽粒中的貯藏物質(zhì)主要是淀粉和蛋白質(zhì)，二者分別在胚乳的淀粉體和蛋白體兩種細(xì)胞器中積累。目前關(guān)于淀粉體發(fā)育的機(jī)理已經(jīng)研究清楚。但關(guān)于小麥胚乳蛋白體的發(fā)育過(guò)程較為復(fù)雜，隨著對(duì)貯藏蛋白研究的不斷深入，人們普遍認(rèn)為小麥胚乳蛋白體的形成方式有兩種，一種是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生途徑，即合成的蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出芽生成蛋白體；另一種是高爾基體小泡形成途徑，即蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成后先經(jīng)過(guò)高爾基體隨后運(yùn)輸?shù)降鞍踪|(zhì)貯藏液泡(protein storage vacuole, PSV)中積累形成蛋白體。這兩種途徑形成的蛋白體其成分不同：通常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生途徑形成的蛋白體中富含HMW-GS，而高爾基體小泡形成途徑合成的蛋白體主要聚集LMW-GS和醇溶蛋白。

其中蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程主要依賴細(xì)胞質(zhì)中包被蛋白復(fù)合體II(coat protein complex II, COPII)介導(dǎo)完成。COPII小泡由5種高度保守的蛋白質(zhì)構(gòu)成：胞質(zhì)GTP酶Ras相關(guān)蛋白1(Sar1)、內(nèi)衣被組分Sec23和Sec24及外衣被組分Sec13和Sec31。隨著對(duì)COPII小泡研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)Sec24表面分布有多個(gè)運(yùn)輸物質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，可以和運(yùn)輸物質(zhì)的信號(hào)肽相互作用，進(jìn)而將運(yùn)輸物質(zhì)招募到初期小泡中，它會(huì)在COPII小泡介導(dǎo)的蛋白質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Nakano等在不同物種里Sec24有不同數(shù)量的亞型，例如，酵母有兩個(gè)：Iss1/Sfb2和Lst1/Sfb3；擬南芥有三個(gè)：Sec24a、Sec24b和Sec24c，每個(gè)亞型的功能非冗余且作用不可忽視。近年來(lái)人們陸續(xù)展開(kāi)對(duì)Sec24的研究，其中研究最多的是Sec24a亞型。最新的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，與COPII小泡的其它組分相比，Sec24a亞型的多樣性程度最高。而小麥中關(guān)于Sec24基因的研究鮮有報(bào)道。在前期研究工作中本課題組對(duì)施氮前后的小麥胚乳進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)小麥Sec24基因有3個(gè)亞型，分別是Sec24a、Sec24b和Sec24c，其中Sec24a受氮素影響顯著，它的表達(dá)水平與蛋白含量呈正相關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量升高時(shí)，小麥Sec24a基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著的變化。本研究通過(guò)半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)揚(yáng)麥158的根、幼葉、葉鞘、成熟葉、小穗和籽粒等組織中Sec24基因三個(gè)基因亞型的表達(dá)量差異進(jìn)行初步分析，以期為后續(xù)探明Sec24a基因?qū)ε呷榈鞍左w發(fā)育和貯藏蛋白積累的分子調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為中筋小麥品種“揚(yáng)麥158”，種子由揚(yáng)州市里下河地區(qū)農(nóng)科所提供。分別取幼苗期的根、莖與葉，花粉發(fā)育期的幼穗與葉和結(jié)實(shí)期的穎果(花后8 d)所有樣品經(jīng)液氮速凍后，置于-80 ℃超低溫冰箱保存用于RNA提取。

2.2 總RNA提取和cDNA的合成

根據(jù)Plant Total RNA Purification Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA片段的完整性，經(jīng)質(zhì)檢合格后，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以總RNA為模板，按照RevertAidTM First Strand cDNA Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)取進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系包括：20～50 μg總RNA、1 μL Oligo (dT)18；12μL RNase-free的水將之補(bǔ)至12 μL、4 μL 5×RT Buffer、1 μLRNase Inhibitor、2 μL dNTP mix、1 μL Reverse Transcriptase。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min, 反應(yīng)結(jié)束后將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板放至-20 ℃冰箱中保存。

2.3 半定量PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)

表1為RT-PCR和qRT-PCR的反應(yīng)引物序列。Actin基因PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。分別以Sec24的三個(gè)亞型的基因序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 循環(huán)；72 ℃10 min；4℃保存。

qRT-PCR的反應(yīng)體系共10 μL，主要包括：cDNA稀釋液(模板)1 μL，正反向引物各0.3 μL，AceQ qPCRSYBR Green Master Mix 5 μL(Vazyme)，ROX Reference Dye1 0.3 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至10 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性1 min，95 ℃(15 s)，60 ℃(30 s)，72 ℃(30 s)，總的40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)是在正常運(yùn)行的Stratagene Mx 3000P儀器上進(jìn)行。通過(guò)溶解曲線來(lái)判斷引物的特異性和可用性，采用2-△△CT法來(lái)分析每一個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因及內(nèi)參基因RT-PCR和qRT-PCR引物序列

3 結(jié)果與分析

3.1 基于半定量RT-PCR對(duì)Sec24基因的不同亞型的初步表達(dá)分析

我們分別對(duì)小麥不同器官中Sec24基因的三個(gè)亞型Sec24a、Sec24b和Sec24c的表達(dá)量進(jìn)行了半定量RT-PCR分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1中可以看出，Sec24的三個(gè)亞型并非是特異性表達(dá)的基因，它在小麥的各個(gè)器官中均會(huì)表達(dá)，在根中表達(dá)量較高，在旗葉中的表達(dá)量最低，尤其是Sec24a基因亞型在旗葉中的表達(dá)最少，Sec24c次之。根據(jù)圖中條帶的明暗程度來(lái)看，Sec24a基因亞型在不同組織中的表達(dá)程度比Sec24b和Sec24c兩個(gè)基因型的要低。

3.2 基于qRT-PCR對(duì)Sec24基因不同亞型的初步表達(dá)分析

qRT-PCR分析結(jié)果(圖2)表明，Sec24的三個(gè)基因亞型(Sec24a、Sec24b和Sec24c)在不同器官中均檢測(cè)到有表達(dá)，但表達(dá)量高低存在明顯差異，從整體水平上看，Sec24a在各器官中的相對(duì)表達(dá)量要低于Sec24b和Sec24c。分別對(duì)不同組織中的同一個(gè)基因亞型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Sec24a基因亞型在不同組織中的表達(dá)量為：根>花后28d小麥穎果>花后8d小麥穎果>花后18d小麥穎果>莖>幼穗>旗葉；Sec24b基因亞型為：根>花后28d小麥穎果>幼穗>花后8d小麥穎果>莖>花后18d小麥穎果>旗葉；Sec24c基因亞型為：根>花后18d小麥穎果>花后8d小麥穎果>花后28d小麥穎果>莖>幼穗>旗葉。從圖2中可以看出，三個(gè)基因亞型均在根中的表達(dá)量最高，旗葉中的表達(dá)量最低，尤其是Sec24c基因型最為明顯，該結(jié)果與圖1所示的相對(duì)表達(dá)量一致。

圖中A 花后8 d小麥穎果；B花后18 d小麥穎果；C花后28 d小麥穎果；D旗葉；E莖；F幼穗；G根；Ta54825為內(nèi)參基因

圖1小麥Sec24基因的三個(gè)亞型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中表達(dá)半定量結(jié)果

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半定量RT-PCR對(duì)揚(yáng)麥158的根、幼葉、葉鞘、成熟葉、小穗和籽粒等組織中Sec24a、Sec24b和Sec24c三個(gè)基因亞型進(jìn)行初步的表達(dá)差異分析，結(jié)果顯示這三個(gè)基因亞型均不是組織特異性表達(dá)的基因，它們能在不同的組織中表達(dá)，但表達(dá)量之間存在很明顯的差異。Sec24基因的三個(gè)基因亞型具體行使哪些功能，Sec24a基因亞型怎樣調(diào)控胚乳蛋白體發(fā)育和貯藏蛋白積累，都還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這些問(wèn)題的解決或許將有助于深化谷物胚乳貯藏蛋白積累和蛋白體發(fā)育機(jī)制的研究，而且對(duì)我國(guó)優(yōu)質(zhì)專用小麥品種的選育和加工品質(zhì)的改良具有重要的科學(xué)意義和現(xiàn)實(shí)意義。

圖中A花后8 d小麥穎果；B花后18 d小麥穎果；C花后28 d小麥穎果；D旗葉；E莖；F幼穗；G根；不同小寫字母間的數(shù)據(jù)存在顯著性差異(p<0.05)

圖2小麥Sec24基因的三個(gè)亞型Sec24a、Sec24b、Sec24c在不同器官中相對(duì)表達(dá)量