詹 穎，杜祎甜，仰湞臻，張春麗，齊憲榮△

(1. 北京大學藥學院藥劑學系，北京大學藥學院分子藥劑學與新釋藥系統(tǒng)北京市重點實驗室， 北京 100191； 2. 北京大學第一醫(yī)院核醫(yī)學科， 北京 100034)

腫瘤是影響人類健康的重大疾病，如腦膠質(zhì)瘤是極具侵襲性的腦部腫瘤，患者死亡率高、生存期短[1]；乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，侵襲性強，極易復發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。對腫瘤的治療通常包括手術(shù)切除、放療、化療、光熱治療和免疫治療等，其各有利弊，外科切除的缺點在于難以根治、容易復發(fā)，化療、放療對患者產(chǎn)生的毒副作用較大。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是經(jīng)典的抗腫瘤藥物，目前已有紫杉醇注射液(商品名：泰素?，Taxol)、紫杉醇白蛋白納米粒、紫杉醇脂質(zhì)體等多種劑型應用到臨床中，但也面臨著給藥次數(shù)多、存在安全隱患、患者依從性差等問題[3]。微球是一種良好的緩釋劑型[4]，可以定向植入，減少全身毒副作用，目前已經(jīng)上市的微球產(chǎn)品有注射用醋酸亮丙瑞林微球等，用于絕經(jīng)前乳腺癌或前列腺癌的治療。隨著材料學的發(fā)展，有更多生物相容性優(yōu)良的材料應用到微球制劑當中，其中聚乳酸羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA]具有生物可降解性，它作為一種安全的藥用輔料被《美國藥典》收錄，采用PLGA制備的紫杉醇微球(paclitaxel microspheres，PTX/M)在腫瘤治療中具有良好的前景。

原位凝膠是一種安全方便的新劑型，它以液體的形式給藥，進入體內(nèi)后迅速發(fā)生相轉(zhuǎn)變，在給藥部位形成半固體儲庫[5]。微球和凝膠的結(jié)合，一方面彌補了微球突釋的缺陷，另一方面延長了微球在病灶部位的停留，提高了藥物在局部的有效濃度從而獲得更好的抗腫瘤效果。Elkharraz等[6]制備了PTX/M和脂質(zhì)的復合物，通過局部注射的方式治療腦瘤，可以延長藥物在腦部的作用時間。本研究首先選用聚氧乙烯和聚氧丙烯組成的嵌段共聚物泊洛沙姆(Poloxamer)作為溫敏凝膠材料，它作為一種無毒、無刺激性藥用輔料被《美國藥典》收錄，并且廣泛應用在口服、注射和局部用藥物制劑中[7]，Shelke等[8]使用Poloxamer 407作為基質(zhì)制備了鹽酸那拉曲坦的鼻腔給藥凝膠，延長了藥物在體內(nèi)的停留時間，避免了反復給藥。Pluta等[9]使用Poloxamer 407制備了甲氨蝶呤的溫敏凝膠系統(tǒng)，用于實體瘤的治療。本研究選用PLGA作為微球材料，制備了PTX/M，進一步制備得到載紫杉醇微球的原位凝膠，通過局部注射的方式給藥，減少了給藥次數(shù)，降低了毒副反應，達到了較好的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1藥品和試劑 紫杉醇，北京諾瑞醫(yī)藥技術(shù)有限公司；泰素?(Taxol)，美國百時美施貴寶公司；PLGA(75/25，Inherent Viscosity 0.65 dL/g)，LACTEL?Absorbable Polymers；Poloxamer 407和Poloxamer 188，北京風禮精求商貿(mào)有限責任公司；高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器 BP211D電子分析天平，德國Sarto-rius 公司；LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)，日本Shimadzu公司；3K-15低溫高速離心機，德國Sigma公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；BT-9300H型激光粒度分布儀，丹東市百特儀器有限公司；Rheometer RS300流變儀，德國Thermo Haake公司。

1.1.3動物 BALB/c裸鼠，雄，6～8周，體重 18～20 g；BALB/c小鼠，雌，6～8周，體重18～20 g，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，北京大學醫(yī)學部實驗動物部清潔級動物房飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1PTX/M的制備 通過乳化溶劑揮發(fā)法[6，10]制備不同粒徑大小的PTX/M。稱取適量PLGA溶于5 mL二氯甲烷，400 r/min磁力攪拌使其充分溶解，而后加入40 mg PTX分散在其中；在轉(zhuǎn)速分別為1 600、1 000和600 r/min的條件下，將得到的有機相緩慢滴加至50 mL含20 g/L聚乙烯醇[poly (vinyl alcohol)，PVA]的水相溶液中進行乳化，繼續(xù)攪拌半小時后將轉(zhuǎn)速降為400 r/min，攪拌過夜使二氯甲烷揮發(fā)完全；最后用去離子水將微球洗滌、凍干。

1.2.2微球粒徑和形態(tài)的測定 使用激光粒度分布儀測定微球的粒徑大小和分布。將適量微球加入含0.02%(體積分數(shù))吐溫80的溶液中并稀釋至適宜濃度，渦旋，使其分散均勻待測。通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察微球的形態(tài)，將雙面膠帶粘附于銅錠上，取適量凍干后的微球樣品置于其上，涂布均勻，噴金后選取適當倍數(shù)進行觀察。

1.2.3包封率和載藥量的測定 采用HPLC測定微球中PTX的含量。取新鮮制備的PTX/M混懸液適量，離心后用0.5%(體積分數(shù))甲醇溶液洗滌微球兩次，乙腈破乳，此時測得的PTX濃度記作Cencap，洗滌之前測得的PTX濃度記作Ctotal，計算PTX/M中PTX的包封率(encapsulation efficiency，EE)和載藥量(drug loading，DL)：EE =Cencap/Ctotal×100%，DL =Wencap/ (WPTX+WPLGA) ×100%，式中Wencap、WPTX、WPLGA分別代表包封的PTX質(zhì)量、初始PTX和PLGA的質(zhì)量。

1.2.4PTX/M的體外釋放 將適量PTX/M分散于磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)中，在100 r/min、37 ℃的恒溫搖床中連續(xù)釋放1個月，分別在第2、5、10、20、30天取1 mL釋放液，1 000 r/min離心4 min后取上清，HPLC檢測PTX濃度。測得釋放第i天的PTX濃度記作Ci，釋放前的PTX濃度記作C0，計算累積釋放百分率：Accumulated release percent=∑Wi/W0×100%，式中Wi為測得的釋放液中PTX的質(zhì)量(i=2,5,10,20,30)，W0為釋放前微球中PTX的質(zhì)量。另外，收集釋放結(jié)束時的微球樣品進行SEM拍照，觀察此時微球的形態(tài)。

1.2.5原位凝膠的制備 通過冷置溶解法制備原位凝膠。稱取適量Poloxamer 407和Poloxamer 188于燒杯中，加入一定量的生理鹽水，4 ℃靜置過夜，即得空白凝膠(blank gel)。PTX/M gel的制備方法與其類似，將PTX/M分散在生理鹽水中，按相同的方法制備即可。

1.2.6相轉(zhuǎn)變溫度的測定 采用試管翻轉(zhuǎn)法測定原位凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度。將制得的空白凝膠或PTX/M gel溶液從4 ℃取出，置于透明玻璃試管中，使用水浴從4 ℃開始升溫，2 min升高1 ℃，并在每攝氏度平衡3 min，仔細觀察并記錄試管中溶液失去流動性時的溫度，作為相轉(zhuǎn)變溫度(T)。每個樣品平行測定3次。

1.2.7凝膠的流變學性質(zhì) 使用流變儀對凝膠的模量進行測定。先選擇Oscillation(f)模式，即振蕩(頻率)模式，頻率用f表示，再選擇應力傳感模式，恒定τ=1.00 Pa，頻率取點范圍0.01～10 Hz，對數(shù)取點。取3 mL樣品于樣品臺上，降低旋轉(zhuǎn)頭至Gap=1.00 mm，恒溫后自動開始測試。

1.2.8凝膠的溶蝕與釋放 取空白凝膠、PTX/M gel溶液各1 mL置于已知重量的玻璃小瓶中，PTX/M gel中PTX/M的濃度為4 g/L，37 ℃恒溫使其充分成膠。加入1 mL PBS(37 ℃預熱)作為釋放介質(zhì)，在37 ℃、100 r/min恒溫搖床中震蕩，每隔30 min取出全部釋放介質(zhì)，對剩余凝膠迅速稱重，然后補充新鮮介質(zhì)1 mL。相鄰時間點樣品的重量反映了凝膠的溶蝕情況，計算凝膠的累積溶蝕百分率：Accumulated dissolution percent = (m0-mt)/m0×100%，式中m0指凝膠初始重量，mt指t時刻剩余凝膠的重量。另外，用HPLC測定釋放介質(zhì)中PTX/M的濃度，繪制凝膠釋放曲線和溶蝕曲線，并考察它們的相關(guān)性。

1.2.9凝膠的通針性與體內(nèi)滯留時間 使用1 mL注射器將臺盼藍標記的生理鹽水與凝膠溶液同時注射到37 ℃水浴中，拍照觀察。另外使用BALB/c小鼠，在其背部注射100 μL臺盼藍標記的凝膠溶液，在第2、4、6、12、24和48 h分別處死小鼠，觀察凝膠的滯留情況。對照組小鼠注射等量臺盼藍標記的生理鹽水。

1.2.10體內(nèi)抗U87 MG腫瘤藥效的研究 建立人源U87 MG的皮下腫瘤模型，待裸鼠的腫瘤體積長至100 mm3左右時將其隨機分成3組，每組6只，按以下方案給藥：(1)對照組,生理鹽水；(2)PTX/M gel組,PTX給藥劑量20 mg/kg；(3)Taxol組,PTX給藥劑量5 mg/kg。給藥當天記作第1天，Taxol組的荷瘤裸鼠從第1天起每周尾靜脈給藥100 μL，其余各組均為第1天瘤旁單次給藥100 μL。實驗期間每兩天記錄腫瘤的生長情況和裸鼠體重，計算腫瘤體積：Tumor volume (mm3)= 0.5×a×b2，a和b分別代表腫瘤的長徑和短徑。另外，處死裸鼠后解剖取其心、肝、脾、肺、腎，用于HE染色，并計算臟器指數(shù)：Organ coefficient = organ weight (g) / net body weight (g)×100%。

1.2.11體內(nèi)抗4T1腫瘤藥效的研究 建立鼠源4T1的皮下腫瘤模型，待小鼠的腫瘤體積長至100～200 mm3時將其隨機分成3組，每組10只，按以下方案給藥：(1)對照組,生理鹽水；(2)PTX/M gel組,PTX給藥劑量20 mg/kg；(3)Taxol組,PTX給藥劑量5 mg/kg。給藥當天記作第1天，Taxol組的荷瘤小鼠從第1天起每周尾靜脈給藥100 μL，其余各組均為第1天瘤旁單次給藥100 μL。實驗期間每兩天記錄腫瘤的生長情況和小鼠體重，計算腫瘤體積。另外，小鼠死亡后取其肺組織置于Bouin’s固定液中固定24 h，觀察肺轉(zhuǎn)移情況。

1.2.12預防4T1腫瘤術(shù)后復發(fā)的研究 建立鼠源4T1的皮下腫瘤模型，待小鼠的腫瘤體積長至100～200 mm3時進行手術(shù)切除腫瘤，切除的腫瘤體積占腫瘤總體積的90%左右，同時按以下方案給藥：(1)對照組，生理鹽水；(2)PTX/M gel組，PTX給藥劑量20 mg/kg；(3)Taxol組，PTX給藥劑量5 mg/kg。手術(shù)及給藥當天記作第1天，Taxol組小鼠從第1天起每周尾靜脈給藥100 μL，其余各組均為第1天瘤腔內(nèi)單次給藥100 μL。實驗期間觀察腫瘤復發(fā)情況，記錄復發(fā)后腫瘤大小和小鼠生存期。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。對多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法，P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 微球的性質(zhì)與表征

通過乳化溶劑揮發(fā)法得到3種不同粒徑的PTX/M，記作PTX/M 16、PTX/M 10和PTX/M 06，分別代表攪拌速度為1 600、1 000和600 r/min時制得。圖1為不同微球的粒徑分布圖，表1是對不同微球的粒徑、比表面積(specific surface area，SSA)、包封率和載藥量的比較。由此可知，攪拌速度是影響微球大小的主要因素，隨著轉(zhuǎn)速的降低，微球的粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，同時伴隨著微球比表面積的減小以及PTX/M包封率和載藥量的增大。

Blue line represents cumulative distribution and red line reresents difference distribution.圖1 PTX/M 16(A)、PTX/M 10(B)和PTX/M 06(C)的粒徑分布Figure 1 The particle diameter distribution of PTX/M 16 (A), PTX/M 10 (B), PTX/M 06 (C)

表1 PTX/M 16、PTX/M 10和PTX/M 06粒徑、比表面積、包封率和載藥量的比較Table 1 Comparison of particle diameter, SSA, EE, DL among PTX/M 16, PTX/M 10 and PTX/M 06

2.2 紫杉醇微球的體外釋藥行為

PTX從微球中的累積釋放百分率如圖2所示，釋放初始階段(0～2 d)藥物存在輕微的突釋現(xiàn)象，這是由于吸附在微球表面的游離藥快速釋放導致，之后很長一段時間內(nèi)PTX的釋放表現(xiàn)平穩(wěn)、緩慢。在第30天時，PTX/M 16、PTX/M 10、PTX/M 06的累積釋放百分率分別為43.34%±12.45%，33.56%±3.33%，19.89%±2.23%，對于三批不同的PTX/M，粒徑越大，微球中的PTX釋放越慢，這與其具有較小的比表面積有關(guān)。綜合考慮PTX/M的包封率和釋放特性，本研究選用PTX/M 10進行后續(xù)實驗。

PTX, paclitaxel; PTX/M, paclitaxel microspheres. Data are presented as the (n=3).圖2 PTX/M 16、PTX/M 10和PTX/M 06中PTX的體外累積釋放曲線Figure 2 Percentage of accumulated release of PTX from PTX/M 16, PTX/M 10 and PTX/M 06, respectively

2.3 微球的掃描電鏡照片

圖3A、B是新鮮制備的PTX/M分別放大500倍和2 000倍的SEM照片，由圖可見微球呈規(guī)則的圓球形，分散性良好，少粘連。圖3C、D是釋放30 d時微球分別放大500倍和2 000倍的SEM照片，此時由于PLGA發(fā)生降解[11]，微球失去了完整的面貌，彼此粘連，內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露。

圖3 新鮮制備的PTX/M(A、B)和降解30 d后的PTX/M(C、D)掃描電鏡照片F(xiàn)igure 3 SEM micrographs of PTX/M (A, B) and degraded PTX/M after 30 days (C, D)

2.4 相轉(zhuǎn)變溫度

當Poloxamer 407濃度為17.5%(質(zhì)量分數(shù))時，不同濃度的Poloxamer 188對凝膠相轉(zhuǎn)變溫度的影響如表2所示，可見當Poloxamer 407濃度一定時，相轉(zhuǎn)變溫度會隨著Poloxamer 188濃度的增加呈現(xiàn)升高的趨勢；與同濃度的空白凝膠相比，PTX/M gel相轉(zhuǎn)變溫度較低，這可能與微球在凝膠中與Poloxamer彼此接觸有利于其交聯(lián)有關(guān)；當Poloxa-mer 188濃度為2.6%(質(zhì)量分數(shù))時，基本能滿足體外注射的需求。

表2 Poloxamer 188濃度的改變對凝膠相轉(zhuǎn)變溫度的影響Table 2 Phase transition temperature of gel when the concentration of Poloxamer 188 was changed

PTX/M, paclitaxel microspheres.

2.5 凝膠的流變學性質(zhì)

流變儀對凝膠的測試結(jié)果如圖4所示，G′代表彈性模量，G′′代表損耗模量，當二者的lgG不再變化時，此時的G′為樣品的彈性模量值。空白凝膠在25 ℃和37 ℃時的lgG′分別為3.83和4.31，彈性模量分別為6.7×103Pa和20×103Pa，PTX/M gel在25 ℃和37 ℃時的lgG′分別為3.63和4.25，彈性模量分別為4.2×103Pa和18×103Pa。由此可見，當溫度升高時，不論是空白凝膠還是PTX/M gel都發(fā)生了相轉(zhuǎn)變，從“柔軟”的流動態(tài)凝膠溶液變成了“堅固”的半固體凝膠，彈性模量因此增大；與同一溫度下的空白凝膠相比，PTX/M gel的彈性模量略低，這可能與PTX/M在凝膠中占據(jù)了一定的位置空間，對整體的凝膠系統(tǒng)起到了一定稀釋作用有關(guān)。

2.6 溶蝕與釋放

凝膠的溶蝕行為如圖5所示，在相同的時間內(nèi)，PTX/M gel比空白凝膠的累積溶蝕百分率大，這一方面與載藥會降低凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度有關(guān)，因為凝膠化過程是一個可逆的過程，越容易發(fā)生凝膠化的樣品溶液也就越容易發(fā)生逆凝膠化；另一方面與凝膠的彈性模量有關(guān)，從流變實驗數(shù)據(jù)可知，與空白凝膠相比，微球的加入會降低凝膠的彈性模量，因此，在37 ℃和100 r/min的恒溫搖床條件下，彈性模量較低的凝膠，更容易受外界作用力的影響，使其內(nèi)部的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而發(fā)生溶蝕現(xiàn)象。

圖4 空白凝膠和PTX/M gel在25 ℃、37 ℃時的模量變化Figure 4 Modulus of blank gel and PTX/M gel at 25 ℃, 37 ℃

PTX/M gel的釋放曲線以及“釋放-溶蝕”相關(guān)性考察如圖6所示，PTX/M gel中PTX/M因為自身的重量在溶液形成半固體凝膠之前有一定的沉降，所以在凝膠中不能完全分布均勻，凝膠底部中分散的微球比凝膠頂部多，因此,可以看到隨著凝膠的溶蝕，PTX/M的釋放速率后期高于前期，如果不考慮微球沉降帶來的影響，PTX/M gel的累積釋放百分比和累積溶蝕百分比基本上呈線性相關(guān)，說明凝膠中PTX/M的釋放主要是通過凝膠溶蝕來實現(xiàn)。

PTX/M, paclitaxel microspheres. Data are presented as the (n=3).圖5 Blank gel和PTX/M gel的體外累積溶蝕百分率Figure 5 Accumulated erosion of blank gel and PTX/M gel

PTX/M, paclitaxel microspheres. Data are presented as the (n=3).圖6 PTX/M從PTX/M gel中的累積釋放百分率(A)和溶蝕-釋放相關(guān)曲線(B)Figure 6 Percentage of cumulative release of PTX/M from PTX/M gel (A) and correlation between PTX/M gel release and dissolution (B)

2.7 通針性與體內(nèi)滯留時間

對凝膠的通針性考察結(jié)果如圖7所示，臺盼藍標記的生理鹽水在注射后立即擴散，而凝膠溶液在注射后立即形成了半固體狀凝膠，隨后沉積在玻璃小瓶的底部。對凝膠體內(nèi)滯留時間的考察結(jié)果如圖7C所示，與注射等量臺盼藍標記的生理鹽水組相比，凝膠在注射部位緩慢消除，存留時間可達48 h，生理鹽水在注射后的2 h基本消除完全。

2.8 抑制U87 MG腫瘤生長效應和安全性評價

各組荷瘤裸鼠的腫瘤生長情況如圖8A所示，對照組裸鼠腫瘤體積生長迅猛，治療初期PTX/M gel組的療效與Taxol組相當，治療后期Taxol組在給藥后的2～3 d裸鼠腫瘤體積出現(xiàn)回彈；從總體的趨勢來看，PTX/M gel組一次給藥對腫瘤生長的延緩效果與Taxol組多次給藥的效果相當,甚至更優(yōu)。圖8B～D分別為各組裸鼠的相對體重變化、主要臟器的臟器系數(shù)和HE染色，可以看出，Taxol組裸鼠在治療期間體重下降較多，說明Taxol造成了一定的毒副作用。通常臟器系數(shù)增大表示臟器充血、水腫或增生肥大等,臟器系數(shù)減小表示臟器萎縮及其他退行性改變，三組裸鼠的臟器系數(shù)無顯著性差異,主要臟器的HE染色未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

2.9 抑制4T1腫瘤生長效應和安全性評價

各組荷4T1瘤小鼠的腫瘤生長情況如圖9A所示，對照組小鼠腫瘤體積增長最快，其次是Taxol組，PTX/M gel組在給藥前期對4T1腫瘤生長的延緩作用與Taxol組相差不大，后期PTX/M gel組藥效明顯優(yōu)于其他組。由此可見，PTX/M gel具有較好的緩釋作用，能夠?qū)崿F(xiàn)在腫瘤部位持續(xù)緩慢釋放PTX，并且PTX/M gel局部一次給藥的療效優(yōu)于 Taxol 靜脈多次給藥。圖9B～D分別為對照組、PTX/M gel組、Taxol組內(nèi)各只小鼠的腫瘤生長曲線。

圖9E是各組小鼠的相對體重變化，Taxol組小鼠在第3次給藥后體重出現(xiàn)了明顯的下降，這是由注射Taxol引起的毒副作用，其他組安全性相對良好。

圖9F是對各組小鼠不同程度肺轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計，將肺部長出肉眼可見瘤的小鼠記作重度轉(zhuǎn)移，將肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)≥15的小鼠記作中度轉(zhuǎn)移，將肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)<15的小鼠記作輕度轉(zhuǎn)移。由圖可知，重度轉(zhuǎn)移：Taxol組> 對照組> PTX/M gel組；中度轉(zhuǎn)移：對照組> PTX/M gel組> Taxol組；輕度轉(zhuǎn)移：PTX/M gel組>對照組和Taxol組。

2.10 防腫瘤術(shù)后復發(fā)的藥效評價

用無瘤率(tumor free)來評價小鼠的術(shù)后復發(fā)情況，腫瘤切除后的當日，各組的無瘤率均為100%，當腫瘤再次長出并且體積超過50 mm3時，視作該小鼠出現(xiàn)了復發(fā)，對各組的無瘤率進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖10A所示，PTX/M gel組小鼠發(fā)生腫瘤復發(fā)的時間明顯晚于對照組和Taxol組。圖10B～D分別為對照組、PTX/M gel組和Taxol組小鼠術(shù)后腫瘤的生長情況，可以看出PTX/M gel組小鼠的腫瘤復發(fā)時間晚、腫瘤生長緩慢，說明即使復發(fā)后PTX/M gel組小鼠的腫瘤相比于其他組也得到了更好的控制。圖10E是術(shù)后小鼠的生存曲線，總的來看PTX/M gel組小鼠的存活期比其他組更長。圖10F是肺轉(zhuǎn)移情況，重度轉(zhuǎn)移：Taxol組>對照組>PTX/M gel組；中度轉(zhuǎn)移：對照組和PTX/M gel組>Taxol組；輕度轉(zhuǎn)移：PTX/M gel組>對照組>Taxol組。

圖7 臺盼藍標記的生理鹽水(A)和凝膠溶液(B)注射到37 ℃水浴中的變化；臺盼藍標記的原位凝膠不同時間點時在小鼠皮下的停留情況(C)Figure 7 Changes of saline (A) and gel (B) labeled with trypan blue were injected into water at 37 ℃; Photographs of gel injected into the back of the mouse for 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and control for 2 h (C)

Data are presented as the (n=6).圖8 A，荷U87 MG腫瘤裸鼠的腫瘤生長曲線(*P=0.02，**P=0.002，與對照組比較)；B，裸鼠的相對體重變化；C，主要臟器的臟器指數(shù)(Normal組為沒有荷瘤的裸鼠的臟器系數(shù)[12])；D，主要臟器的HE染色(100×)Figure 8 A, tumor growth curve of U87MG-bearing mice (*P=0.02, **P=0.002, vs. Control); B, relative body weight curve; C, percent of organ relative weight (Normal represents the organ index of normal nude mice[12]); D, HE staining of major organ tissues (100×)

Data are presented as the (n=10).圖9 A，荷4T1腫瘤小鼠的腫瘤生長曲線(*P=0.003，與對照組比較)；B～D，對照組、PTX/M gel組和Taxol組內(nèi)各只小鼠的腫瘤生長曲線；E，小鼠的相對體重變化；F，小鼠肺轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計Figure 9 A, tumor growth curve of 4T1-bearing mice (*P=0.003, vs. Control); B-D, tumor growth curve of each mouse in Control, PTX/M gel, Taxol groups; E, relative body weight-time curve of mice; F, proportion of different degrees of lung metastasis in mice

3 討論

本研究制備了3種不同粒徑大小的PTX/M，體外釋放曲線顯示粒徑越小的微球釋放得越快，這與其具有較大的比表面積有關(guān)，但同時粒徑越小，微球?qū)λ幬锏陌饴屎洼d藥量越低，因此，本研究選取中位粒徑為(32.24±1.09) μm的PTX/M 10進行后續(xù)實驗。本研究制備了PTX/M gel，當Poloxamer 407、Poloxamer 188的濃度分別為17.5%、 2.6%時，其相轉(zhuǎn)變溫度為33 ℃，基本能滿足體外注射的需要。通過標記臺盼藍，可以發(fā)現(xiàn)凝膠在小鼠體內(nèi)的滯留時間達48 h，而體外釋放特性顯示PTX/M在釋放開始的0～2 d有輕微的突釋現(xiàn)象，因此，凝膠能較好地彌補微球突釋的缺陷，使藥物的釋放趨于平穩(wěn)、緩慢。

PTX/M gel在U87 MG腫瘤和4T1腫瘤的治療中均顯示了較好的藥效。由于微球和凝膠的緩釋作用，使得PTX/M gel只需要給藥一次就能達到Taxol給藥三次的效果，甚至優(yōu)于Taxol，并且降低了毒副作用。在防4T1腫瘤術(shù)后復發(fā)的研究中，因為PTX/M gel在瘤腔部位形成了儲庫，緩慢釋放的PTX能夠殺傷術(shù)后殘留的腫瘤細胞，所以該組小鼠出現(xiàn)復發(fā)的時間比對照組和Taxol組都晚，即使在復發(fā)后腫瘤體積也得到了更好的控制。4T1是極易發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤[13]，通過對小鼠的肺轉(zhuǎn)移情況進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)無論是否經(jīng)歷手術(shù)，小鼠均發(fā)生了不同程度的轉(zhuǎn)移，PTX/M gel組小鼠發(fā)生輕度肺轉(zhuǎn)移的比例較多，而Taxol組發(fā)生重度轉(zhuǎn)移的比例最多，這可能因為Taxol組給藥次數(shù)多、毒副作用大，使得小鼠狀態(tài)差、免疫功能下降，所以當Taxol在體內(nèi)完全消除以后，機體難以抑制腫瘤細胞的生長和擴散，而PTX/M gel組因為PTX的長期釋放，對腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移起到了一定程度上的阻礙作用。

圖10 A，小鼠術(shù)后的無瘤率；B～D，對照組、PX/M gel組和Taxol組的小鼠術(shù)后腫瘤生長曲線；E，小鼠術(shù)后的生存曲線；F，小鼠不同程度肺轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計Figure 10 A, tumor free rate after surgery in different drug-administered groups; B-D, tumor growth curve of each mouse after surgery in control, PTX/M gel, Taxol groups; E, survival curve of mice with surgery; F, proportion of different degrees of lung metastasis in mice