謝云波，張紀元，杜美玲，孟繁平，福軍亮，劉利敏，王松山，曲 芮，廉 方，喬 菲，陳楊柳，高瑩瑩，徐若男，施 明，王福生

(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染性疾病診療與研究中心， 北京 100039)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)目前是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因，NK細胞是天然免疫的重要組成部分，在清除病毒感染的細胞和腫瘤細胞中起關(guān)鍵作用。在慢性肝炎發(fā)展為肝癌的過程中，NK細胞功能缺陷與疾病進展密切相關(guān)，同時也是造成腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因[1]。與正常肝組織相比，肝細胞癌患者瘤內(nèi)NK細胞數(shù)量降低、細胞亞群分布改變，識別和殺傷肝癌細胞的功能降低[2-3]。近期研究表明，自體NK細胞治療在多種實體瘤的治療中可以提高外周循環(huán)中NK細胞的活性和數(shù)量，但由于很難遷移到腫瘤部位發(fā)揮功能，臨床療效有限[4-5]。同種異體NK細胞治療近年來被廣泛應(yīng)用于各種臨床試驗。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)不匹配可以抑制自體組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility conplex, MHC)分子的負向調(diào)控信號，保證足夠的NK細胞活化。在急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia, AML)患者中，來自KIR不匹配供體的NK細胞過繼回輸可顯著降低造血干細胞移植后的復(fù)發(fā)率[6]。本研究以患者的健康直系血親為供者，分離外周血單個核細胞并進行NK細胞的體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的第14、15天，分2次回輸給患者，通過對患者進行隨訪，同時評估同種異體NK細胞治療的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年4月至2017年10月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心收治的HCC患者。

患者納入標準：(1)年齡16～65歲的男性或女性患者；(2)按照《原發(fā)性肝癌診療標準(2015年版)》， 患者經(jīng)病理學(xué)和影像學(xué)確診為原發(fā)性肝細胞癌；肝功能Child-Pugh A/B級 (5～9分)，美國東部腫瘤協(xié)作組評分標準(eastern cooperative oncology group score standard, ECOG)評分≤ 2分；(3)血小板計數(shù)>60×109/L；血紅蛋白>80 g/L；凝血：國際標準化比率(international normalized ratio, INR)<2.3，或者凝血時間延長<6 s；血清白蛋白>28 g/L,總膽紅素<51 mmol/L，谷丙/谷草轉(zhuǎn)氨酶<5倍正常值上限；(4)合并乙肝患者進行抗病毒治療，合并丙肝患者服用直接抗病毒(direct-acting antiviral agents, DAA)藥物治療。供者入組標準：(1)年齡18～40 歲的男性或女性且為患者直系血親；(2)理解并簽署知情同意書，且遵循自愿、無償?shù)脑瓌t；(3)排除糖尿病、高血壓、心臟病等慢性疾病，全身無其他重大器質(zhì)性疾病和傳染性疾??；(4)沒有精神障礙，具有完全的行為能力。

患者排除標準：(1)妊娠或哺乳期婦女；(2)器官移植后患者；(3)2 周內(nèi)進行過介入微創(chuàng)治療術(shù)或者1 個月內(nèi)進行過切除手術(shù)的患者；(4)合并甲型肝炎、戊型肝炎、艾滋病等感染者，或有其他傳染性疾?。?5)合并其他嚴重的全身性疾病和精神病患者；(6)篩選前30 d內(nèi)發(fā)生過急性感染、消化道出血等嚴重并發(fā)癥；(7)半年內(nèi)進行過其他生物治療，包括細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cells, CAR-T)、程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1, PD-1)和其他免疫治療的患者。

共入組HCC患者21例，其中男性18例，女性3例，基線資料見表1。本項臨床研究通過中國人民解放軍第三零二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準，所有入組患者和供者均理解并簽署知情同意書。

表1 患者的人口學(xué)和基線特征Table 1 Demographic and baseline characteristics of the patients

ECOG, eastern cooperative oncology group score standard; BCLC, Barcelona clinic liver cancer.

1.2 細胞制備及質(zhì)控

包被：取NK細胞激活劑2 mL至175 cm2培養(yǎng)瓶中，加入20 mL生理鹽水充分混勻并置于4 ℃冰箱過夜。

外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離：采集供者外周血50～80 mL，通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心，800 ×g，25 min；收集上層血漿并于56 ℃滅活30 min；收集單核細胞層細胞，加入生理鹽水重懸，300 ×g，10 min洗滌2次。

細胞培養(yǎng)：用10 mL生理鹽水沖洗包被的培養(yǎng)瓶，將PBMC重懸于NK細胞活化培養(yǎng)基中，使其密度為1×106/mL，分別按照終濃度為50 μg/L、1 000 IU/mL和2.5%分別加入重組人IL-15、重組人IL-2和滅活血漿，混勻后接種于包被培養(yǎng)瓶中；置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；觀察細胞生長狀況并加入擴增培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度至5×105～8×105/mL，按照初始培養(yǎng)濃度加入細胞因子和滅活血漿，每2～3天傳代1次。

細胞收獲：培養(yǎng)14 d和15 d后，用生理鹽水重量細胞300 ×g，8 min洗滌細胞2次，用含1%(體積分數(shù))注射用人白蛋白的生理鹽水懸浮細胞，經(jīng)70 μm細胞篩過濾后轉(zhuǎn)移至輸液袋。

細胞質(zhì)控：分別于培養(yǎng)第0、7、14天取細胞培養(yǎng)懸液進行質(zhì)量檢測，質(zhì)檢內(nèi)容包括微生物學(xué)安全性(細菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測)和生物學(xué)活性(細胞活率、NK細胞純度、NK細胞分泌細胞因子水平、NK細胞殺傷功能檢測)。

1.3 隨訪檢查

首次NK細胞治療開始后4周、8周、12周、24周、36周、48周定期隨訪。隨訪觀察指標包括安全性指標(發(fā)熱及其他不適、血常規(guī)、肝腎功能、心電圖)和有效性指標(臨床癥狀及體征、腫瘤標志物水平、生物化學(xué)指標、影像學(xué)指標、免疫學(xué)指標及生活質(zhì)量評價)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 同種異體NK細胞治療安全性評價

21例患者中，10例患者治療1療程，5例患者治療2療程，5例患者治療3療程。所有患者未見惡心、嘔吐、感染、過敏、昏迷、急性和慢性移植物抗宿主反應(yīng)(graft-versus-host disease, GVHD)。10例患者在細胞輸注后24 h內(nèi)出現(xiàn)短暫發(fā)熱反應(yīng)，其中9例患者體溫為37.3～38.5 ℃，1例患者體溫為38.5～39.5 ℃。1例患者接受NK細胞治療12 h后出現(xiàn)輕微肝痛，1例患者出現(xiàn)輕微頭痛。以上所有患者的癥狀均在8 h內(nèi)自然緩解，無需治療。結(jié)果表明，該劑量的NK細胞治療不超過患者的耐受限度。

在1年的隨訪中，同種異體NK細胞治療后3個月內(nèi)患者淋巴細胞數(shù)量逐漸減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。治療3個月后淋巴細胞計數(shù)恢復(fù)至治療前水平，6個月后淋巴細胞計數(shù)高于基線，然后緩慢恢復(fù)到原水平。中性粒細胞和血小板水平無明顯變化。治療后患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin, TBil)、白蛋白(albumin, ALB)均在正常范圍內(nèi)波動，與基線比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)水平較NK細胞治療前顯著降低。

2.2 同種異體NK細胞治療療效評價

按照實體瘤療效評價(response evaluation criteria in solid tumors, RECIST)1.1標準[7]， 21例同種異體NK細胞治療的HCC患者1年隨訪中，1例(4%)完全緩解，3例(12%)部分緩解，12例(52%)病情穩(wěn)定。所有患者的總疾病控制率為76.2%(表2)，其中BCLC(Barcelona clinic liver cancer) A期患者中疾病控制率為100%, SD 10例；BCLC B期患者中疾病控制率為60%，部分緩解(partial response, PR) 1例，SD 2例；BCLC C期患者中疾病控制率為50%，完全緩解(complete response, CR) 1例，PR 2例。截至2019年5月，接受同種異體NK細胞治療的21例患者中有5例死亡。死亡患者中BCLC C期患者3例，存活時間分別為3個月、4個月和4個月；BCLC B期患者2例，存活時間分別為4個月后、10個月。

表2 NK細胞治療療效評價Table 2 Summary of efficacy measures

2.3 同種異體NK細胞治療后外周免疫變化

同種異體NK細胞過繼回輸后24 h，患者CD4+ T細胞的頻率和CD4/CD8比值較基線顯著升高(圖1)，而NK細胞和CD8+ T細胞的頻率較基線顯著下降，B細胞頻率較治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]到所培養(yǎng)的NK細胞和患者PBMC存在互相殺傷的可能，分別以患者PBMC和供者培養(yǎng)后的NK細胞為靶細胞進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無論是否加入IL-2，供者培養(yǎng)后的NK細胞對患者PBMC均無殺傷作用，但具有正常殺傷腫瘤細胞系的能力。

*P<0.05, ☆P<0.001.圖1 NK細胞治療24 h后患者外周血淋巴細胞亞群變化Figure 1 Changes in the proportion of lymphocyte subsets 24 h after treatment

3 討論

早期的基礎(chǔ)研究顯示,在造血干細胞移植和骨髓移植過程中CD56(bright) NK細胞的百分比與GVHD的發(fā)生密切相關(guān),當移植物中CD56(bright) NK細胞超過3%時，GVHD發(fā)生的概率接近于零[8-10]。本實驗培養(yǎng)NK細胞的中位頻率為80%，遠遠超過造血干細胞移植和骨髓移植中CD56(bright) NK細胞的頻率，但在本試驗研究的1年隨訪過程中，研究沒有觀察到急性和慢性GVHD的發(fā)生，提示同種異體NK細胞在原發(fā)肝癌的臨床應(yīng)用中有很好的安全性。本研究結(jié)果顯示，疾病控制率與同種異體NK細胞治療的療程有關(guān)，治療的療程數(shù)越多，疾病控制率越高，提示異體NK細胞在患者體內(nèi)存在半衰期，多次治療可能會提高治療療效,但由于本臨床試驗樣本量較小，難以控制和調(diào)整混雜因素，這一結(jié)果還需要通過大樣本臨床試驗進一步驗證。

本研究檢測了同種異體NK細胞過繼輸注后HCC患者外周血淋巴亞群的變化，發(fā)現(xiàn)雖然短期內(nèi)輸入了了大量的外源性NK細胞，但患者外周血中NK細胞的數(shù)量和頻率仍然低于治療前水平。同種異體NK細胞輸注后患者外周血CD8 T細胞和NK細胞數(shù)量在24 h內(nèi)降至最低，B細胞在48 h內(nèi)降至最低，1周后逐漸恢復(fù)至正常水平，這一結(jié)果與Qin等[11]的報道相反。本研究將培養(yǎng)的NK細胞與未處理的HCC患者PBMC體外共培養(yǎng)24 h，未觀察到培養(yǎng)的NK細胞對患者PBMC的殺傷作用，也未觀察到患者PBMC對培養(yǎng)NK細胞的殺傷作用，這一結(jié)果可能與Miller等[12]報道的單倍體NK細胞過繼回輸后異體NK細胞在患者體內(nèi)嵌合現(xiàn)象有關(guān)。本研究推測，大劑量同種異體CD56(bright) NK細胞過繼輸注后，可能通過分泌細胞因子激活患者的自然免疫和特異性免疫，誘導(dǎo)患者特異性CD8+T細胞和NK細胞向腫瘤部位遷移，改變腫瘤局部微環(huán)境并殺傷腫瘤細胞。

本研究6例晚期肝癌患者1例治療后完全緩解，回顧分析發(fā)現(xiàn)該患者在接收同種異體NK細胞治療同時也接受索拉非尼治療，提示同種異體NK細胞聯(lián)合索拉非尼可能會延長患者的生存時間。索拉非尼是晚期HCC的靶向治療藥物，據(jù)Llovet等[13]在NEnglJMed報道，索拉非尼可使晚期HCC患者的中位生存期延長近3個月，但在299例單用索拉非尼治療的患者中，沒有一例患者達到CR。回顧2012—2018年在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染性疾病診療與研究中心接受索拉非尼治療的患者，也沒有發(fā)現(xiàn)CR病例。此外，索拉非尼的副作用和耐藥性仍然存在，這極大地限制了索拉非尼的臨床應(yīng)用。既往研究表明[14-15]，索拉非尼可觸發(fā)腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage, TAM)的促炎活性，繼而誘導(dǎo)抗腫瘤NK細胞反應(yīng)，提示NK細胞治療聯(lián)合索拉非尼可使患者獲得更好的臨床療效。在研究3例同種異體NK細胞聯(lián)合索拉非尼患者的總生存時間分別為16個月、19個月、32個月，均存活到2019年5月，遠遠超過報道的10.3個月，提示同種異體NK細胞聯(lián)合索拉菲尼在晚期肝癌的治療中可能具有巨大的潛力。

綜上所述，同種異體NK細胞治療HCC有很好的安全性和有效性，對延長患者生存時間、提高生活質(zhì)量可能具有良好的治療前景。但仍需要進一步通過大樣本、多中心、隨機對照研究評估同種異體NK細胞聯(lián)合索拉菲尼治療晚期肝癌的療效。