楊國(guó)威，彭世澤，張永欣，趙建元，岑山

由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的結(jié)核病是一種重大感染性疾病，嚴(yán)重威脅著我國(guó)和世界的公共衛(wèi)生健康[1-3]。雖然異煙肼等抗結(jié)核藥物可以有效控制藥物敏感菌感染引起的結(jié)核病，但是由于近年來各種耐藥結(jié)核菌的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致藥物治療失敗，結(jié)核病發(fā)病率逐年上升。因此，亟需發(fā)展新型抗結(jié)核藥物以有效控制結(jié)核病的廣泛傳播[4-7]。

由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢、生物安全等級(jí)高，所以結(jié)核病動(dòng)物模型一直是抗結(jié)核藥物研發(fā)的瓶頸問題。由于倫理以及成本等原因，使得靈長(zhǎng)類動(dòng)物難以作為廣泛應(yīng)用的結(jié)核病藥物篩選及理論研究動(dòng)物模型[8]。嚙齒類動(dòng)物模型無法完全模擬人感染結(jié)核分枝桿菌中的多種病理變化[7,9]，具有相當(dāng)?shù)木窒扌?。因此，?gòu)建理想的體內(nèi)動(dòng)物模型對(duì)于抗結(jié)核藥物的研發(fā)尤為關(guān)鍵。

近年來，只具有天然免疫系統(tǒng)的海分枝桿菌-斑馬魚幼魚模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于結(jié)核病致病機(jī)制以及藥物篩選方面的研究，例如結(jié)核病肉芽腫的形成與成熟機(jī)制等基礎(chǔ)研究[10-13]以及依賴熒光的細(xì)菌菌數(shù)計(jì)數(shù)法用于藥物篩選等[14-15]。不同于斑馬魚幼魚，斑馬魚成魚同時(shí)具有先天免疫系統(tǒng)以及后天免疫系統(tǒng)。鑒于后天免疫系統(tǒng)在控制結(jié)核病方面具有關(guān)鍵的作用[16-17]，海分枝桿菌感染斑馬魚成魚模型更為接近正常生理狀態(tài)。目前，盡管海分枝桿菌感染斑馬魚成魚模型已在結(jié)核病致病機(jī)制和結(jié)核病疫苗等方面的研究中廣泛應(yīng)用[18-19]，但在抗結(jié)核藥物評(píng)價(jià)與篩選中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。在本研究中，我們建立了海分枝桿菌-斑馬魚成魚感染模型，并結(jié)合 qPCR 菌數(shù)計(jì)數(shù)法，探索其在抗結(jié)核藥物篩選與評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Mycobacterium.marinumATCC 927 strains 接種于 7H9 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斑馬魚（Danio rerio）AB 系，由本院張靖溥教授惠贈(zèng)。

1.1.3 試劑盒 SYBR Premix Ex Taq II Tli（NaseH Plus）試劑盒購(gòu)自日本 Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 顯微注射 斑馬魚成魚麻醉后，用注射器將菌液由斑馬魚腹腔呈 45° 注射入魚體內(nèi)，每次注射劑量為 100 μl。

1.2.2 利福平的處理方法 海分枝桿菌 927 腹腔注射斑馬魚 24 h 后，向海水中加入適量的藥物，每天給魚換水并加藥；另一組不給藥，每天只更換海水。給藥處理 14 d 后，用 HE 以及 Ziehl-Neelsen 染色的方式，觀察斑馬魚體內(nèi)肉芽腫形成情況，并對(duì)形成的肉芽腫數(shù)采用 qPCR 的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。利福平藥物劑量的選擇是通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果最終確定為 200 和 400 μmol/L 兩個(gè)劑量。

1.2.3 斑馬魚切片染色 斑馬魚用福爾馬林液固定過夜后，依次脫水、透明、包埋和切片。石蠟切片脫蠟后，進(jìn)行 HE 染色和 Ziehl-Neelsen 染色。

1.2.4 qPCR 測(cè)定海分枝桿菌 DNA 將待處理的斑馬魚放入 -20 ℃ 凍存一段時(shí)間后，解剖取其內(nèi)臟，將樣品勻漿后，用 Qiagen 試劑盒提取樣品中的基因組 DNA。擴(kuò)增 16S～23S，ITS 引物為 F：5' CACCACGAGAAACACTCCAA 3'；R：5' ACA TCCCGAAACCAACAGAG 3'。反應(yīng)體系為 Mix 12.5 μl、10 mmol/L 引物各 1 μl，DNA 3 μl，用 ddH2O 補(bǔ)至 20 μl。循環(huán)條件為 95 ℃ 10 s，65 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)，使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的 CT 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。1.2.5 IC50的計(jì)算 根據(jù)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組斑馬魚 體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，算出各濃度組對(duì)應(yīng)的抑制率，然后用 Prism 5.01 計(jì)算每個(gè)藥物的 IC50。

2 結(jié)果

2.1 海分枝桿菌感染斑馬魚成魚

首先取 16 只成魚斑馬魚，隨機(jī)分為兩組，然后分別用 5300 CFU 的海分枝桿菌或 PBS 進(jìn)行腹腔注射感染，觀察其成活率一直到第 5 周（圖1）。

圖1 海分枝桿菌 927 感染斑馬魚成魚成活率曲線 Figure 1 Survival ratio of the adult zebrafish were injected with M.marinum strains 927 or PBS

圖2 海分枝桿菌 927 可以導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)產(chǎn)生肉芽腫（A：斑馬魚卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；B：斑馬魚胰腺切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；放大倍數(shù) 200 ×） Figure 2 Granuloma formation of adult zebrafish infected with M.marinum 927 (A：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of ovary; B：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of pancreas; Magnification of 200 ×)

在此注射劑量下，斑馬魚于第 3 周開始死亡。5 周后，死亡率可以達(dá)到 20% 左右。第 5 周對(duì)斑馬魚進(jìn)行切片，分別用 Ziehl-Neelsen 以及 HE 染色，觀察斑馬魚體內(nèi)肉芽腫的形成，以及海分枝桿菌的分布情況。HE 染色顯示，斑馬魚卵巢、腸系膜、胰腺處形成數(shù)目眾多的肉芽腫；Ziehl-Neelsen 染色顯示肉芽腫處存在海分枝桿菌（圖2）。上述結(jié)果說明海分枝桿菌 927 可以感染斑馬魚成魚形成肉芽腫，并且會(huì)導(dǎo)致斑馬魚的死亡。

2.2 利福平可以減少海分枝桿菌感染斑馬魚體內(nèi)的肉芽腫數(shù)目和細(xì)菌數(shù)

圖3 利福平對(duì)斑馬魚成魚結(jié)核病的治療作用（A：對(duì)照組斑馬魚卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；B：利福平 400 μmol/L 給藥組斑馬魚卵巢切片 HE 和 Ziehl-Neelsen 染色；C：各處理組斑馬魚體內(nèi)肉芽腫數(shù)；D：各處理組斑馬魚體內(nèi)細(xì)菌數(shù)；放大倍數(shù) 200 ×；*P ＜ 0.05） Figure 3 Rifampicin can rescue the infected zebrafish (A：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of the control group; B：Ziehl-Neelsen staining and HE staining of 400 μmol/L rifampicin group; C：Granulomas of each group; D：CFU of each group; Magnification of 200 ×; *P ＜ 0.05)

選用利福平對(duì)感染了海分枝桿菌的斑馬魚成魚進(jìn)行治療，驗(yàn)證其作為抗結(jié)核藥物評(píng)價(jià)體系的 可行性。取 30 只斑馬魚成魚，用 5 × 103CFU 的海分枝桿菌 927 進(jìn)行注射感染，然后隨機(jī)分為 3 組，分別用利福平 200 和 400 μmol/L 處理，另一組作為對(duì)照。治療兩個(gè)星期后，用 HE 以及 Ziehl-Neelsen 染色的方式，觀察斑馬魚體內(nèi)肉芽腫形成情況，并對(duì)形成的肉芽腫數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組在卵巢處最容易形成數(shù)目眾多 的未成熟的肉芽腫，而 400 μmol/L 給藥組沒有肉芽腫（圖3A 和 3B）。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組肉 芽腫數(shù)目平均達(dá)到 28 個(gè)，200 μmol/L 給藥組有 5.6 個(gè)，而高劑量組未發(fā)現(xiàn)肉芽腫，三者具有顯著性差異（圖3C）。結(jié)果表明，抗結(jié)核藥物可以有效抑制海分枝桿菌 927 感染斑馬魚所形成的肉芽腫。同時(shí)，利用 qPCR 測(cè)定細(xì)菌數(shù)目的方法，測(cè) 定了各組斑馬魚體內(nèi)的海分枝桿菌數(shù)量。研究表明，對(duì)照組海分枝桿菌的數(shù)目明顯上升，達(dá)到 9 × 105CFU，200 μmol/L 給藥組海分枝桿菌達(dá)到 4 × 104CFU，而 400 μmol/L 給藥組斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)沒有增長(zhǎng)，表明斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)與肉芽腫數(shù)目有明顯的相關(guān)性，也說明抗結(jié)核藥物利福平可以對(duì)斑馬魚成魚結(jié)核病進(jìn)行治療，斑馬魚成魚感染模型可以用于抗結(jié)核藥物的篩選。

2.3 應(yīng)用 qPCR 計(jì)算利福平成魚給藥的 IC50

用 qPCR 計(jì)數(shù)法計(jì)算斑馬魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)，并計(jì)算利福平的 IC50。結(jié)果如圖4所示，利福平的 IC50為 52.5 μmol/L，與前期在斑馬魚幼魚身上算出的 IC50（42.5 μmol/L）基本相似，表明了利福平對(duì)幼魚以及成魚的治療效果相似，也說明應(yīng)用海分枝桿菌感染斑馬魚成魚模型進(jìn)行藥物篩選的可靠性。

圖4 利福平濃度抑制率曲線 Figure 4 Rifampicin concentration-inhibitory rate curve

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染的一個(gè)重要特征就是形成肉芽腫，它是由被感染的巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋 巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞相互作用形成的干酪樣壞死結(jié)構(gòu)[7]。海分枝桿菌感染斑馬魚，并表現(xiàn)為感染早期細(xì)菌數(shù)目的急劇增多以及干酪樣肉芽腫的形成，與結(jié)核桿菌感染哺乳動(dòng)物的病程和病理表現(xiàn)非常相似[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用不同濃度的海分枝桿菌 927 注射斑馬魚成魚會(huì)對(duì)斑馬魚的存活率造成不同的影響[18]。在本研究里我們應(yīng)用（5300 ± 1066）CFU 海分枝桿菌 927 劑量下注射斑馬魚成魚，到第 5 周，斑馬魚的死亡率可以達(dá)到 20% 左右，并且經(jīng) HE 染色顯示，斑馬魚卵巢、腸系膜、胰腺處形成數(shù)目眾多的肉芽腫，并經(jīng) Ziehl-Neelsen 染色證明了海分枝桿菌在肉芽腫處的存在。而對(duì)照組在卵巢處最容易形成數(shù)目眾多的未成熟的肉芽腫，因此，在利福平用于治療感染了海分枝桿菌的斑馬魚時(shí)，我們重點(diǎn)開展了對(duì)卵巢肉芽腫的分布和數(shù)量的分析。

本研究中，我們?cè)诤７种U菌感染斑馬魚成魚模型上建立了基于 qPCR 計(jì)數(shù)法的抗結(jié)核藥物藥效評(píng)價(jià)系統(tǒng)。通過 qPCR 計(jì)數(shù)法，可以準(zhǔn)確地對(duì)斑馬魚成魚體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)而對(duì)藥物的給藥效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)結(jié)合 Ziehl-Neelsen染色以及 HE 染色，可以檢測(cè)斑馬魚體內(nèi)的肉芽腫的 數(shù)目和形態(tài)，因而可以系統(tǒng)地、深入地對(duì)藥物的 給藥效果進(jìn)行分析。同時(shí)，應(yīng)用海分枝桿菌感染斑馬魚模型可以在免疫系統(tǒng)正常的體內(nèi)生理環(huán)境下初步評(píng)價(jià)先導(dǎo)化合物的有效性及其體內(nèi)毒性，進(jìn)而快速判斷化合物的成藥性，有效地降低藥物篩選的成本。